Separazione e frazionamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare da Mycobacterium tuberculosis per l'analisi delle proteine a valle

La nostra ricerca si è concentrata sullo sviluppo di un metodo semplificato per separare le proteine insolubili della parete cellulare e della membrana cellulare di Mycobacterium tuberculosis in frazioni semplici per saggi proteomici e immunologici diretti. I progressi nelle tecniche elettroforetiche consentono ora di separare proteine complesse in un minor numero di frazioni proteiche, facilitando un efficiente isolamento basato su spettrometria di massa per applicazioni proteomiche e immunologiche funzionali. Le sfide principali includono la scarsa solubilità della proteina idrofobica che precipita oltre i cento milligrammi e la denaturazione indotta da SDS-PAGE, che ostacola l'applicazione a valle che necessita di una conferma nativa come i saggi di attività enzimatica.

Nessun protocollo attuale separa sistematicamente le proteine insolubili della parete cellulare idrofobica e della membrana cellulare in frazioni idrosolubili definite per l'analisi proteomica e immunologica diretta, che è la chiave per comprendere la funzione e guidare gli interventi. La nostra ricerca futura si concentrerà sullo sviluppo di diagnostica basata sull'antigene delle cellule T e sulla valutazione della loro sensibilità, specificità e prestazioni nella popolazione di TBC per una diagnosi precoce e accurata della TB con l'obiettivo di supportare un migliore controllo della malattia. Per iniziare, ottenere la parete cellulare, la membrana cellulare e i campioni di proteine citosoliche dal lisato di cellule intere dei bacilli del Mycobacterium tuberculosis.

Solubilizzare la parete cellulare e le proteine della membrana cellulare in un tampone a focalizzazione isoelettrica. Aggiungere il 2% di anfoliti tra intervalli di pH da 3 a 10 e da 4 a 6 in un rapporto da uno a quattro. Ora frazionare le proteine solubilizzate in un sistema liquido di focalizzazione isoelettrica mantenuto a quattro gradi Celsius con un bagno d'acqua di raffreddamento.

Eseguire la separazione isoelettrica della messa a fuoco seguendo le istruzioni del produttore applicando una potenza costante di 12 watt. Raccogliere le singole frazioni a focalizzazione isoelettrica con una pompa a vuoto. Determinare i valori di pH di ciascuna frazione.

Sottoporre 50 microgrammi delle frazioni separate a SDS-PAGE e visualizzare le proteine utilizzando la colorazione Coomassie Brilliant Blue o argento. Inizia mescolando la parete cellulare separata da IIF e le frazioni della membrana cellulare con il tampone del campione per elettroforesi su gel SDS. Scaldare il composto a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Separare le frazioni proteiche nella seconda dimensione, utilizzando gel di poliacrilammide da 16 x 20 centimetri con un gel risolutivo al 12,5% e un gel impilabile al 4%. Quindi utilizzare un singolo pozzetto per campioni lungo 13 centimetri per caricare il campione sul gel. Eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 50 milliampere per gel fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.

Dopo l'elettroforesi, equilibrare il gel nel tampone di eluizione per 10 minuti. Trasferire il gel in un intero apparecchio per gel elettrico secondo le istruzioni del produttore dello strumento. Far funzionare l'eluter a una corrente costante di 250 milliampere per un'ora per eluire le proteine dal gel, quindi utilizzare una pompa a vuoto per raccogliere circa 30 frazioni proteiche, ciascuna delle quali misura tre millilitri, dal gel.

Quantificare la concentrazione proteica nelle frazioni eluite utilizzando il saggio proteico dell'acido bicinconinnico. Sottoporre 10 microgrammi delle frazioni proteiche eluite all'analisi SDS-PAGE e visualizzare le bande mediante colorazione Coomassie Brilliant Blue. Nel primo surnatante sono stati osservati distinti modelli di bande proteiche: parete cellulare, membrana cellulare e frazioni di citosol di Mycobacterium tuberculosis, confermando il successo del frazionamento subcellulare.

La focalizzazione isoelettrica delle proteine della parete cellulare ha mostrato la più alta concentrazione proteica nelle frazioni con pH inferiore a 2,5. SDS-PAGE delle frazioni IEF della parete cellulare ha rivelato bande proteiche distinte, prevalentemente nelle frazioni da 1 a 8. La separazione delle proteine della membrana cellulare mediante IEF ha rivelato importanti picchi di concentrazione proteica tra pH 4 e pH 10, con la concentrazione più alta che si verifica intorno a pH 10.

SDS-PAGE delle frazioni IEF della membrana cellulare ha mostrato diversi profili proteici con bande più chiare nelle frazioni da 1 a 9. La separazione preparativa SDS-PAGE delle proteine della parete cellulare risolte dall'IIF ha prodotto frazioni prevalentemente inferiori a 100 microgrammi per millilitro. SDS-PAGE delle frazioni proteiche della parete cellulare eluite ha mostrato un'ampia gamma di pesi molecolari proteici, con bande più concentrate nelle frazioni da 6 a 10.

La SDS-PAGE preparativa delle frazioni proteiche della membrana cellulare ha rivelato che oltre la metà delle frazioni aveva concentrazioni proteiche comprese tra 50 e 199 microgrammi per millilitro. SDS-PAGE delle frazioni proteiche della membrana cellulare eluite ha rivelato bande concentrate nelle corsie da 1 a 8 e da 13 a 16.