Sul posto Isolamento e coltura di batteri del suolo recalcitranti utilizzando un chip di isolamento (iChip)

Ricchi depositi di microbi esistono in diversi ambienti naturali, come il suolo, i corpi idrici e gli ambienti estremi. Tuttavia, l'attingere a questa enorme biodiversità è in gran parte limitato dai metodi di laboratorio e dai mezzi. Superando questa barriera culturale e attingendo a questa biodiversità, si ha il potenziale per affrontare varie esigenze biotecnologiche, oltre a risolvere le sfide globali.

Ad esempio, lo sviluppo della resistenza antimicrobica è diventato un fattore di salute pubblica globale. I batteri del suolo difficili da coltivare in laboratorio possono produrre nuovi composti bioattivi con una potente attività antimicrobica che potrebbero essere preziosi per affrontare la sfida globale dei sistemi antimicrobici. L'enorme varietà di microbi ambientali e il loro prodotto non sono stati esplorati poiché le tradizionali tecnologie di laboratorio basate sulla coltura spesso portano all'isolamento di microbi noti simili. L'obiettivo di questo esperimento è dimostrare la coltura ad alto rendimento di batteri del suolo recalcitranti in situ utilizzando la tecnologia IChip. In questo protocollo, dimostreremo la costruzione e l'uso di questa tecnologia IChip che può essere utilizzata per la coltivazione in situ ad alta produttività di batteri difficili da coltivare e il recupero di batteri che producono antimicrobici come applicazione di questa tecnologia.

[Presentatore] Per iniziare, crea un progetto preliminare delle piastre superiore, inferiore e centrale del chip di isolamento in un software di presentazione. Utilizzare l'opzione Inserisci forma nel software di presentazione per inserire cerchi di dimensioni necessarie che fungano da IChip. Inserisci cerchi più piccoli all'interno per rappresentare i canali IChip. Disponi i cerchi più piccoli nel modello desiderato per preparare un disegno preliminare per la piastra superiore, inferiore e centrale dell'IChip. Seleziona il disegno e usa il menu di scelta rapida per salvare il progetto preliminare come immagine. Utilizzando il progetto preliminare come modello, inizia a creare un progetto bidimensionale utilizzando un software di progettazione assistita da computer. Dal menu di schizzo, inserire forme predefinite, prevalentemente cerchi per creare il disegno di base per le piastre IChip e l'area dei canali. Utilizzare l'opzione di quota per impostare le dimensioni effettive delle piastre e dei canali. Fare clic su OK per finalizzare il progetto, quindi utilizzare la funzione di estrusione per convertire il progetto 2D in un modello 3D dello spessore desiderato. Infine, utilizzare il menu file per salvare una copia del modello 3D nel formato di file litografia compatibile con la stampa 3D.

[Presentatore] Raccogli tutti gli elementi essenziali che saranno necessari per la raccolta del campione di terreno e raggiungi il sito da cui deve essere raccolto il campione. Apri l'applicazione mobile di geocodifica e trova l'indirizzo univoco di tre parole del sito di campionamento e registralo. Successivamente, registra i metadati del campione pertinenti, come la temperatura, la data, l'ora, la profondità del campionamento, le condizioni meteorologiche e l'esposizione del sito agli elementi. Spruzzare una pala e la scatola di polistirolo in cui deve essere piantato l'IChip con il 70% di etanolo. Puliscili con carta velina e lascia asciugare completamente l'etanolo all'aria. Quindi utilizzare la pala decontaminata per rimuovere eventuali detriti superficiali, come la lettiera di foglie o le rocce per esporre il terreno superficiale. Decontaminare nuovamente la pala come prima. Usando la pala, accedi al terreno a una profondità compresa tra tre e sei anni, ingerisci il sottosuolo e trasferisci circa quattro o cinque kg di terreno da una profondità uniforme nella scatola di polistirolo. La scatola dovrebbe essere piena circa al 75%. Trasportare immediatamente il terreno raccolto in laboratorio. Dal campione di terreno raccolto, pesare un grammo di terreno privo di detriti, rocce e lettiera di foglie in una provetta da centrifuga sterile da 50 mil contenente 10 ml di soluzione fisiologica sterile. Mescola il terreno con la soluzione salina mentre fai vorticare per circa 10 secondi per creare un impasto di terreno. Lasciare la provetta da centrifuga indisturbata per cinque minuti per consentire alle particelle di terreno di grandi dimensioni nella provetta di depositarsi. Quindi trasferire con cura la sospensione di terreno surnatante in una nuova provetta etichettata come S. Utilizzando la sospensione di terreno come campione non diluito, eseguire la diluizione zero trasferendo un ml di campione in nove ml di soluzione fisiologica sterile in una provetta nuova. Preparare la diluizione da 10 è a potenza meno uno a 10 è a potenza meno cinque. All'interno di una cabina di biosicurezza, decontaminare la piastra superiore, la piastra inferiore e la piastra centrale dell'IChip immergendole in etanolo al 70% per 10 minuti. Sciacquare l'etanolo in eccesso lavando i componenti IChip con acqua deionizzata sterile e lasciarli asciugare all'aria in una capsula di Petri sterile. Posizionare la piastra centrale dell'IChip in una capsula di Petri sterile pronta per la semina. Sciogliere il mezzo di coltura SMS agar in un forno a microonde. Lasciarlo raffreddare, quindi trasferire 22,5 ml di agar SMS a 45 gradi in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml. A questo, aggiungere 2,5 ml di un'appropriata diluizione del campione di terreno e mescolare bene con una leggera inversione evitando l'introduzione di bolle d'aria. Versare lentamente circa tre o quattro ml del terreno di coltura SMS agar seminato sulla piastra centrale dell'IChip coprendo l'intera superficie. Quindi lasciare che il mezzo di agazionamento SMS si fissi per circa 5-10 minuti. Controllare se il mezzo di trasmissione SMS è impostato. Quindi, con la lama del rasoio sterile, raschiare l'eccesso di agar SMS dalla superficie della piastra metallica IChip lasciando dietro di sé i tappi di agar nelle singole camere di diffusione. Dopo aver rimosso il foglio protettivo da uno dei filtri a membrana in policarbonato da 0,03 micrometri, posizionarlo con cura all'interno della lama superiore dell'IChip utilizzando una pinza sterile. Quindi posizionare un altro filtro a membrana in policarbonato da 0,03 micrometri sul lato esposto della piastra metallica seminata utilizzando una pinza sterile. Posizionare le piastre superiore e inferiore dell'IChip, inserendo la piastra centrale e le membrane in policarbonato, avendo cura di allineare questi fori per le viti in tutte le piastre per completare l'assemblaggio dell'IChip. Serrare saldamente i dadi e i bulloni per fissare il gruppo IChip. Creare una depressione più grande della dimensione dell'IChip nel raccoglitore di terreno nella scatola di polistirolo usando una pala sterile. Piantare il gruppo IChip verticalmente all'interno della depressione e imballarlo con il terreno assicurandosi che tutte le superfici dell'IChip siano completamente coperte. Quindi consentire l'in-situ in coltura per la durata desiderata da due a quattro settimane. Durante l'incubazione, utilizzare periodicamente acqua distillata sterile per inumidire l'ambiente circostante il terreno, l'IChip piantato, per evitare che i tappi di agar SMS seminati nella camera di diffusione si secchino. Dopo l'incubazione desiderata, rimuovere delicatamente il terreno attorno all'IChip piantato per recuperarlo. Quindi lavare l'IChip con soluzione fisiologica sterile per rimuovere le particelle di sporco aderenti e trasferirlo all'interno di una cabina di biosicurezza per un'ulteriore lavorazione. Svitare i dadi e il bullone dal gruppo IChip e smontare con cura l'IChip. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere le membrane in policarbonato e trasferire la piastra centrale dell'IChip nella capsula di Petri preparata. Utilizzare un applicatore di legno sterile per recuperare i singoli tappi di agar all'interno di ciascuna camera di diffusione. Inoculare le spine di agar in terreni appropriati come l'agar SMS o l'agar brodo di soia triptico 0,1X per tentare la coltivazione in laboratorio. Gli isolati coltivati possono quindi essere sottoposti a screening per la produzione di antimicrobici con metodi di routine, come il rivestimento di agar utilizzando ceppi tester. Qui mostriamo i risultati di screening rappresentativi per 12 colture, da IC-1 a 12 ottenute da tappi di agar IChip contro Staphylococcus aureus ATCC 29213 e Acinetobacter baumannii B8342. Si noti che le colture IC-6 e IC-8 mostrano attività rispettivamente contro ceppi tester gram-positivi e gram-negativi. In alternativa, colorare e visualizzare i tappi di agar recuperati contenenti batteri del suolo recalcitranti coltivati in situ per confermare la crescita di micro colonie in condizioni di in-situ. Utilizzando questo approccio, è possibile recuperare i batteri recalcitranti del suolo in situ in modo ad alto rendimento. L'IChip stampato in 3D può ospitare 156 tappi di agar. Tuttavia, è necessario scegliere la giusta diluizione durante la semina per garantire che una cellula batterica venga seminata in ciascun canale dell'IChip. I batteri necessari possono quindi essere sottoposti a screening per le bioattività desiderate, come la produzione di metaboliti, la produzione di enzimi, la produzione di biopolimeri, eccetera, se possono essere coltivati in condizioni di laboratorio. Tuttavia, è anche probabile che alcuni batteri non crescano in condizioni di laboratorio e, in tali casi, potremmo dover adottare approcci metagenomici per renderci conto della presenza microbica e per accedere al loro potenziale biosintetico. Il metodo descritto è molto semplice e può essere facilmente utilizzato per la bioprospezione di microbi in diverse condizioni ambientali con piccole modifiche.