Cellule Neurali Della Cresta Cranica Protocollo Tridimensionale In Vitro Di Differenziazione Per Saggio Multiplexed

Siamo interessati a capire come vengono regolate determinate decisioni durante lo sviluppo. I modelli di organoidi e le tecnologie a singola cellomica ci permettono di porre domande che prima non erano possibili. L'utilizzo di modelli di organoidi in vitro ci permette di generare una maggiore quantità di dati, soprattutto per popolazioni cellulari transitorie, come la cresta neurale.

I risultati significativi del modello di variabilità rimangono una grande sfida sperimentale. Abbiamo dimostrato che le cellule della cresta cranica riesprimono i geni di prepotenza per espandere il potenziale di differenziazione. Per iniziare, preparare una soluzione di collagenasi fresca a una concentrazione di due milligrammi per millilitro nel mezzo di knockout DMEM.

Aspirare il terreno ESC dalla piastra a pozzetti contenente dal 70 all'80% di mESC confluente. Ora, aggiungi delicatamente un millilitro di PBS sul lato del pozzo. Scuotere la piastra per garantire un lavaggio uniforme.

Pipettare il PBS e sostituirlo con due millilitri di soluzione di collagenasi. Incubare a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Controllare la piastra al microscopio ottico con un ingrandimento di 10X dopo 20 minuti di incubazione e poi ogni cinque minuti.

Quando le colonie mostrano i bordi arrotolati, picchiettare energicamente sul lato della piastra per staccare le colonie. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, raccogliere le colonie staccate e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le colonie a 16 G per tre minuti a temperatura ambiente.

Aspirare quanto più terreno possibile dal tubo conico senza disturbare le colonie sul fondo. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina allo 0,05% al pellet e incubare. Con le micropipette P1000 e P200, pipettare energicamente la sospensione su e giù per dissociare le colonie, quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura mESC per bloccare la tripsina.

Centrifugare la provetta a 160 G per tre minuti a temperatura ambiente. Pipettare il surnatante, quindi aggiungere un millilitro di terreno di differenziazione CNCC. Contare le cellule con un dispositivo di conteggio cellulare automatizzato o al microscopio, quindi diluire le cellule in mezzo di differenziazione CNCC per ottenere una concentrazione di 3.000 cellule vive per 50 microlitri.

Con una micropipetta P200, seminare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U non trattata con TC. Rabboccare ogni pozzetto a 200 microlitri con il terreno di differenziazione CNCC e incubare. Osservare la piastra contenente la coltura di cellule differenziate 24 ore su 24 al microscopio ottico per assicurarsi che piccoli grappoli con bordi chiari siano visibili sul fondo di ciascun pozzetto.

Rimettere la piastra nell'incubatrice per una notte. Il secondo giorno, rimuovere lentamente 100 microlitri di terreno da ciascun pozzetto. Quindi, utilizzare una micropipetta P200 con la punta tagliata a tre o quattro millimetri dall'estremità per aspirare le neurosfere insieme al terreno rimanente.

Trasferire le neurosfere e il terreno rimanente in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC. Verificare il trasferimento al microscopio ottico. Rabboccare ogni pozzetto fino a 200 microlitri di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato.

Il quarto giorno, aspirare 100 microlitri di terreno da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 100 microlitri di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato, quindi incubare di nuovo. Il quinto e il sesto giorno, controlla l'attaccamento delle neurosfere al microscopio ottico.

Assicurarsi che le cellule più leggere che si delaminano dalle neurosfere inizino a circondare il suo corpo principale. Preparare il mezzo di manutenzione CNCC secondo la composizione indicata. Filtrare l'albumina sierica bovina attraverso un filtro da 0,22 micrometri prima di aggiungerla al terreno.

Una volta aggiunti i fattori di crescita, conservare il terreno a quattro gradi Celsius per un massimo di tre settimane, assicurandosi che sia protetto dalla luce. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di fibronectina in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti non trattata con TC. Mentre la piastra è a riposo, aspirare quanto più mezzo di differenziazione CNCC possibile dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC.

Sostituire il terreno con 50 microlitri di Accutase. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di mantenimento CNCC in ciascun pozzetto per estinguere l'Accutase.

Rimuovere la fibronectina dai pozzetti rivestiti della piastra ricevente. quindi filtrare il CNCC post-migratorio distaccato attraverso un filtro da 40 micrometri nei pozzetti della piastra ricevente. Nel momento desiderato, utilizzare una micropipetta P200 con punta tagliata per trasferire le neurosfere dalla piastra a 96 pozzetti in una provetta da due millilitri a basso legame del DNA.

Dopo aver lasciato riposare le neurosfere nella provetta per tre minuti a temperatura ambiente, pipettare quanto più terreno possibile, quindi risciacquare con un millilitro di PBS freddo. Per preparare le camere di montaggio, posizionare tre strati di nastro biadesivo trasparente senza fibre su un vetrino da microscopio. Con un rasoio, taglia una finestra di tre millimetri per otto millimetri nel nastro biadesivo.

Sotto uno stereoscopio, con una punta tagliata in P200, pipettare con cura le neurosfere dell'agente di pulizia nella camera di montaggio. Utilizzare ingrandimenti compresi tra 2X e 4X per fornire un campo visivo dell'intera camera e identificare le neurosfere. Posizionare un vetrino coprioggetti sulla superficie della camera e premere leggermente i lati per farlo aderire.

Le colture di neurosfere in piastre non tissutali hanno mostrato attacchi uniformi a partire dal quinto giorno, mentre le colture di piastre di Petri hanno mostrato un attacco variabile e la fusione delle neurosfere, particolarmente evidente entro il quarto giorno. La variabilità delle dimensioni delle neurosfere è risultata significativamente ridotta nelle colture su piastra a 96 pozzetti rispetto alle colture con piastra di Petri nei giorni quattro e sette. Il diametro delle neurosfere nelle piastre a 96 pozzetti variava da 139 micrometri a 295 micrometri il quarto giorno e da 383 micrometri a 552 micrometri il settimo giorno, mentre le colture di piastre di Petri hanno mostrato un intervallo più ampio.

La crescita della neurosfera è stata esponenziale in termini di numero di cellule, passando da una media di 1.082 cellule il secondo giorno a 48.352 cellule il nono giorno. La crescita del diametro è stata lineare, passando da una media di 136 micrometri il secondo giorno a 570 micrometri il nono giorno. L'analisi in immunofluorescenza ha confermato che le neurosfere e le cellule delaminanti esprimono i marcatori CNCC AP2 alfa e SOX9 e il marcatore EMT TWIST1 nei giorni nove e 13.

PAX7 era presente solo nelle neurosfere.