Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici
February 28th, 2025
Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.
Le vescicole extracellulari fungono da biomarcatori della malattia, riflettendo gli stati fisiologici. Il nostro approccio consente l'estrazione di dati da piccoli volumi di lacrime, facendo progredire la ricerca sulle vescicole extracellulari nei fluidi biologici. Le principali sfide sperimentali includono l'ottenimento di concentrazioni sufficienti di vescicole extracellulari da piccoli campioni, la riduzione al minimo della perdita di campione durante l'isolamento e l'ottimizzazione dell'analisi per prevenire la sovrasaturazione del chip o il rilevamento di segnali deboli.
Questo protocollo bypassa le fasi di isolamento, riducendo i tempi di elaborazione, e consente l'analisi delle vescicole extracellulari da volumi di campione minori, rendendolo ideale per campioni biologici limitati, come le lacrime. I biomarcatori non invasivi sono fondamentali per la diagnosi precoce e la gestione dei disturbi corneali. I biomarcatori delle vescicole extracellulari consentono il monitoraggio della malattia, trattamenti personalizzati, una migliore compliance del paziente e una migliore qualità della vita.
Il nostro laboratorio è stato all'avanguardia nell'analisi delle vescicole extracellulari in campioni lacrimali di soggetti KC, identificando firme tEV uniche. Questo apre la strada a future diagnosi e obiettivi terapeutici incentrati sulle vescicole extracellulari. Per iniziare, disponi i campioni biologici e un chip di tetraspanina sull'area di lavoro.
Pipettare 70 microlitri di campioni biologici umani che sono stati premiscelati con la soluzione B di un kit di tetraspanina umana su un chip. Posizionare la pellicola su una piastra di lavaggio dei trucioli per evitare l'evaporazione del campione. Dopo 16 ore, posizionare la piastra nella lavatrice per trucioli.
Bloccarlo in posizione e chiudere il coperchio. Premere l'opzione CW-TETRA v0 sulla rondella trucioli. Durante il lavaggio delle patatine, preparare 300 microlitri di soluzione bloccante per patatina.
Aggiungere 0,6 microlitri di ciascun anticorpo per chip alla soluzione bloccante. Agitare la soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi per garantire una miscelazione accurata. Al termine del lavaggio dei trucioli, aggiungere 250 microlitri di soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi sopra ogni chip.
Quindi chiudere il coperchio e premere Continua. Quando la rondella dei trucioli emette un segnale acustico, rimuovere la piastra di lavaggio dei trucioli. Sposta le fiches su per la rampa.
Riposizionare la piastra nella rondella per trucioli, assicurandosi che si blocchi saldamente in posizione. Chiudere il coperchio e premere Continua. Per iniziare, accendi un analizzatore di nanoparticelle.
Avviare il programma software di scansione sul desktop collegato all'analizzatore di nanoparticelle. Selezionare la cartella dei trucioli per scegliere ogni truciolo di tetraspanina e posizionarlo nella posizione del truciolo sul mandrino. Fare clic sui tre quadrati sotto la posizione del chip per attivare la fluorescenza.
I quadrati diventeranno gialli, blu e rossi. Premere sul coperchio del mandrino e tirarlo per rimuoverlo. Quindi fissare saldamente i chip di tetraspanina caricati con campione sul mandrino.
Allineare i pioli del coperchio del mandrino con i fori e premere verso il basso. Far scorrere il coperchio per bloccarlo in posizione. Quindi posizionare il mandrino sul tavolino e bloccarlo in posizione.
Quindi, fai clic su Scansiona chip dall'interfaccia del software, quindi fai clic su OK. Una volta che il tavolino si sposta completamente all'interno della macchina, chiudere lo sportello. Al termine della scansione, aprire lo sportello per espellere il tavolino e verificare i risultati. Se le scansioni sono andate a buon fine, scartare le fiches.
Posiziona la prossima serie di chip sul mandrino. In alternativa, riportare il mandrino vuoto sul tavolino. Uscire dal software e spegnere la macchina al termine.
Livelli ottimali di fluorescenza delle vescicole extracellulari sono stati osservati nei canali CD63, CD81 e CD9, mentre il canale di controllo MIgG è rimasto nero, confermando la specificità del controllo. Il CD81 è stato ridotto per i fluidi biologici. L'assenza di fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9 è indicativa di un'assenza di vescicole extracellulari.
Lasovrasaturazione della fluorescenza era evidente, rendendo difficile discernere dati significativi a causa dell'eccessiva marcatura, in particolare nei canali CD63, CD81 e CD9.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo innovativo per caratterizzare le vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici umani, come lacrime e saliva. Utilizzando un chip tetraspanin, l'approccio facilita l'analisi delle EV da volumi di campione minimi, facendo progredire lo studio dei biomarcatori non invasivi per il monitoraggio delle malattie.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Vesciccole extracellulari
- Biomarcatori non invasivi
- Malattie oculari
Contesto
- Le EV fungono da indicatori di stati fisiologici e malattie
- Le sfide includono basse concentrazioni in campioni piccoli e tempo di elaborazione del campione
- Importanza della diagnosi precoce dei disturbi corneali
Metodi utilizzati
- Uso di un chip tetraspanin per l'analisi delle EV
- Campioni biologici umani (lacrime)
- Rilevamento basato sulla fluorescenza dei marcatori EV CD63, CD81 e CD9
Risultati principali
- L'integrazione dei passaggi di preparazione e analisi del campione riduce il tempo di elaborazione
- I livelli di fluorescenza dei marcatori EV hanno confermato specificità e presenza
- Identificazione delle firme tEV nei campioni di lacrime di soggetti con cheratocono
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio semplificato all'analisi delle EV da piccoli campioni biologici
- I risultati supportano future diagnostiche e obiettivi terapeutici nella salute oculare
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
