Name: Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Scopri un metodo innovativo per caratterizzare le vescicole extracellulari da fluidi biologici umani utilizzando un chip di tetraspanina. Questa tecnica facilita l'analisi di campioni minimi, supportando lo sviluppo di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio delle malattie oculari.

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<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Incuba, lava, risciacqua e asciuga le scaglie di tetraspanina. Questo modello attuale non è più disponibile. Prezzo al momento dell'acquisto: $ 9.995,00</td></tr><tr><td>Software ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Analizza le informazioni sul chip e produce file excel per ulteriori analisi. Non è più disponibile.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Utilizzato per scansionare i chip di tetraspanina a 3 lunghezze d'onda. Questo modello attuale non è più disponibile. Prezzo al momento dell'acquisto:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>Software per scanner ExoView</td><td>NanoView N</td><td>/ A</td><td>Scansiona i chip a 3 diverse lunghezze d'onda. Non è più disponibile.</td></tr><tr><td>Kit di tetraspanina umana</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>Include 8 chip di tetraspanina, soluzione di incubazione, soluzione di blocco, anticorpo CD63, anticorpo CD81, anticorpo CD9, soluzione A, soluzione B, USB e coperchio della piastra.</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Quando si analizzano le macchie sui chip, puntare a una concentrazione ottimale di vescicole extracellulari osservando le vescicole extracellulari marcate in fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9, e il canale MIgG30,91 dovrebbe rimanere nero, poiché questo è il canale di controllo come mostrato nella Figura 3A. Il CD81 sarà ridotto per i fluidi biologici. Se non c'è fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9, c'è un'assenza di vescicole extracellulari (Figura 3B). Fare attenzione a non saturare eccessivamente il chip (Figura 3C). Ciò renderà difficile per il software di analisi calcolare l'accuratezza delle dimensioni, del conteggio totale delle particelle e dei fenotipi delle vescicole extracellulari. Dai punti della concentrazione ottimale, il software di analisi sarà in grado di misurare le dimensioni (50-200 nm), il conteggio totale delle particelle e l'espressione della tetraspanina delle vescicole extracellulari (Figura 4) e sarà esportato in singoli fogli di calcolo per ulteriori analisi. L'analisi delle tetraspanine includerà la colocalizzazione delle proteine di superficie sulle vescicole extracellulari. La colocalizzazione sarà rappresentata con una "/", ad esempio "CD63/CD81". Ciò non significa che CD63 e CD81 siano combinati; significa che sia il CD63 che il CD81 si trovano sulla superficie dell'EV.
Questi risultati forniranno preziose informazioni tra campioni sani e malati. Saremo in grado di determinare se i campioni sani o i campioni malati producono più vescicole extracellulari, vescicole extracellulari più grandi o più piccole e il fenotipo delle vescicole extracellulari. Alcune o tutte queste caratteristiche potrebbero svolgere un ruolo nella biogenesi e/o nella progressione della malattia. Con questi risultati, saremo in grado di vedere se c'è un'assenza o un aumento dei livelli di tetraspanina, che possono fornire informazioni sui processi cellulari e sulla formazione di vescicole extracellulari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Figura 1: I tipi e le dimensioni dei diversi veicoli elettrici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Figura 2: Schema di come i chip di tetraspanina catturano e rilevano le vescicole extracellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Figura 3: Ottimizzazione delle concentrazioni di EV. (A) Concentrazione ottimale di vescicole extracellulari. (B) Risultato negativo: non sono presenti EV. (C) Sovrasaturazione dei veicoli elettrici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Figura 4: Dati generati dall'analizzatore di nanoparticelle. (A) Dimensione del diametro EV misurata in nanometri. (B) Conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari. (C) Fenotipo colocalizzato EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecnica</td>
			<td>Vantaggi</td>
			<td>Limitazioni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuga</td>
			<td>Elevata purezza42,43</td>
			<td>Modifiche Morfologia EV42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Omogeneità42,45</td>
			<td>Richiede un grande volume42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Funzionalità42,43</td>
			<td>Costoso42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citometria a flusso</td>
			<td>Valutare i campioni in più punti temporali47</td>
			<td>Segnale debole48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Endpoint multipli47,50</td>
			<td>Pori ostruiti51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analisi EV singola ad alto rendimento52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugazione in gradiente di densità</td>
			<td>Produzione di campioni altamente puri54</td>
			<td>Manodopera intensiva55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Varietà di campioni55,57</td>
			<td>Richiede tempo55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Perdita di resa significativa54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitazione</td>
			<td>Semplice59,60</td>
			<td>Contaminazione36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Veloce61,62</td>
			<td>Non specifico63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Alta resa44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH neutro36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtrazione</td>
			<td>Semplice64 </td>
			<td>Esosomi trappola65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Veloce64</td>
			<td>Danneggia le grandi vescicole36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Economico64</td>
			<td>Torta filtrante66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Intasamento degli esosomi65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Vantaggi e limiti delle tecniche di isolamento delle vescicole extracellulari. Un elenco dei vari modi per isolare i veicoli elettrici, compresi i loro vantaggi e limiti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecnica</td>
			<td>Vantaggi</td>
			<td>Limitazioni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffusione dinamica della luce</td>
			<td>Misura di particelle di dimensioni comprese tra 1 nm e 6 μM78 </td>
			<td>Non adatto per la misurazione di campioni di esosomi complessi con ampio intervallo di dimensioni79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Il limite inferiore è di 10 nm adatto per sistemi monodispersi79 </td>
			<td>Non è in grado di distinguere le proteine contaminate dagli esosomi79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)</td>
			<td>Osservare la morfologia degli esosomi79,80 </td>
			<td>Preparazioni complicate dei campioni79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Osservare la struttura interna81 </td>
			<td>Non è in grado di distinguere gli esosomi in base alle dimensioni e alla forma a causa di segnali di fluorescenza esagerati82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analisi di tracciamento delle nanoparticelle</td>
			<td>Misurare la concentrazione, le dimensioni e la distribuzione dimensionale degli esosomi nell'intervallo da 10 nm a 2 μM78 </td>
			<td>Non è possibile differenziare le vescicole extracellulari dagli aggregati proteici e da altri contaminanti83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Preparazione e misurazione rapide del campione78,84</td>
			<td>Costoso strumento NTA85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I campioni possono essere recuperati in forma nativa84 </td>
			<td>Sensibile alle vibrazioni85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot (WB)</td>
			<td>può analizzare qualitativamente e quantitativamente le proteine marcatrici79,86 </td>
			<td>Complicato e dispendioso in termini di tempo79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analisi degli esosomi da terreni di coltura cellulare79 </td>
			<td>Gli isolati di EV possono contenere lipoproteine e altri contaminanti86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citometria a flusso</td>
			<td>Maggiore sensibilità e imaging ad alta risoluzione per</td>
			<td rowspan="2">Lungo e laborioso con limite di rilevamento di 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distinguere gli esosomi colorati dai contenimenti87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bassa concentrazione del campione richiesta79 </td>
			<td>I segnali ottici ostacolano la precisione e la risoluzione88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>Misurazione delle tetraspanine (CD9, CD63 e CD81) sugli esosomi89 </td>
			<td>Non misura veicoli elettrici di dimensioni maggiori75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Misura EV cargo proteine90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Vantaggi e limiti delle tecniche di caratterizzazione delle vescicole extracellulari.

Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Le vescicole extracellulari fungono da biomarcatori della malattia, riflettendo gli stati fisiologici. Il nostro approccio consente l'estrazione di dati da piccoli volumi di lacrime, facendo progredire la ricerca sulle vescicole extracellulari nei fluidi biologici. Le principali sfide sperimentali includono l'ottenimento di concentrazioni sufficienti di vescicole extracellulari da piccoli campioni, la riduzione al minimo della perdita di campione durante l'isolamento e l'ottimizzazione dell'analisi per prevenire la sovrasaturazione del chip o il rilevamento di segnali deboli.Questo protocollo bypassa le fasi di isolamento, riducendo i tempi di elaborazione, e consente l'analisi delle vescicole extracellulari da volumi di campione minori, rendendolo ideale per campioni biologici limitati, come le lacrime. I biomarcatori non invasivi sono fondamentali per la diagnosi precoce e la gestione dei disturbi corneali. I biomarcatori delle vescicole extracellulari consentono il monitoraggio della malattia, trattamenti personalizzati, una migliore compliance del paziente e una migliore qualità della vita.Il nostro laboratorio è stato all'avanguardia nell'analisi delle vescicole extracellulari in campioni lacrimali di soggetti KC, identificando firme tEV uniche. Questo apre la strada a future diagnosi e obiettivi terapeutici incentrati sulle vescicole extracellulari. Per iniziare, disponi i campioni biologici e un chip di tetraspanina sull'area di lavoro.Pipettare 70 microlitri di campioni biologici umani che sono stati premiscelati con la soluzione B di un kit di tetraspanina umana su un chip. Posizionare la pellicola su una piastra di lavaggio dei trucioli per evitare l'evaporazione del campione. Dopo 16 ore, posizionare la piastra nella lavatrice per trucioli.Bloccarlo in posizione e chiudere il coperchio. Premere l'opzione CW-TETRA v0 sulla rondella trucioli. Durante il lavaggio delle patatine, preparare 300 microlitri di soluzione bloccante per patatina.Aggiungere 0,6 microlitri di ciascun anticorpo per chip alla soluzione bloccante. Agitare la soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi per garantire una miscelazione accurata. Al termine del lavaggio dei trucioli, aggiungere 250 microlitri di soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi sopra ogni chip.Quindi chiudere il coperchio e premere Continua. Quando la rondella dei trucioli emette un segnale acustico, rimuovere la piastra di lavaggio dei trucioli. Sposta le fiches su per la rampa.Riposizionare la piastra nella rondella per trucioli, assicurandosi che si blocchi saldamente in posizione. Chiudere il coperchio e premere Continua. Per iniziare, accendi un analizzatore di nanoparticelle.Avviare il programma software di scansione sul desktop collegato all'analizzatore di nanoparticelle. Selezionare la cartella dei trucioli per scegliere ogni truciolo di tetraspanina e posizionarlo nella posizione del truciolo sul mandrino. Fare clic sui tre quadrati sotto la posizione del chip per attivare la fluorescenza.I quadrati diventeranno gialli, blu e rossi. Premere sul coperchio del mandrino e tirarlo per rimuoverlo. Quindi fissare saldamente i chip di tetraspanina caricati con campione sul mandrino.Allineare i pioli del coperchio del mandrino con i fori e premere verso il basso. Far scorrere il coperchio per bloccarlo in posizione. Quindi posizionare il mandrino sul tavolino e bloccarlo in posizione.Quindi, fai clic su Scansiona chip dall'interfaccia del software, quindi fai clic su OK. Una volta che il tavolino si sposta completamente all'interno della macchina, chiudere lo sportello. Al termine della scansione, aprire lo sportello per espellere il tavolino e verificare i risultati. Se le scansioni sono andate a buon fine, scartare le fiches.Posiziona la prossima serie di chip sul mandrino. In alternativa, riportare il mandrino vuoto sul tavolino. Uscire dal software e spegnere la macchina al termine.Livelli ottimali di fluorescenza delle vescicole extracellulari sono stati osservati nei canali CD63, CD81 e CD9, mentre il canale di controllo MIgG è rimasto nero, confermando la specificità del controllo. Il CD81 è stato ridotto per i fluidi biologici. L'assenza di fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9 è indicativa di un'assenza di vescicole extracellulari.La sovrasaturazione della fluorescenza era evidente, rendendo difficile discernere dati significativi a causa dell'eccessiva marcatura, in particolare nei canali CD63, CD81 e CD9.

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Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

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