Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici
28 febbraio 2025
Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.
Le vescicole extracellulari fungono da biomarcatori della malattia, riflettendo gli stati fisiologici. Il nostro approccio consente l'estrazione di dati da piccoli volumi di lacrime, facendo progredire la ricerca sulle vescicole extracellulari nei fluidi biologici. Le principali sfide sperimentali includono l'ottenimento di concentrazioni sufficienti di vescicole extracellulari da piccoli campioni, la riduzione al minimo della perdita di campione durante l'isolamento e l'ottimizzazione dell'analisi per prevenire la sovrasaturazione del chip o il rilevamento di segnali deboli.
Questo protocollo bypassa le fasi di isolamento, riducendo i tempi di elaborazione, e consente l'analisi delle vescicole extracellulari da volumi di campione minori, rendendolo ideale per campioni biologici limitati, come le lacrime. I biomarcatori non invasivi sono fondamentali per la diagnosi precoce e la gestione dei disturbi corneali. I biomarcatori delle vescicole extracellulari consentono il monitoraggio della malattia, trattamenti personalizzati, una migliore compliance del paziente e una migliore qualità della vita.
Il nostro laboratorio è stato all'avanguardia nell'analisi delle vescicole extracellulari in campioni lacrimali di soggetti KC, identificando firme tEV uniche. Questo apre la strada a future diagnosi e obiettivi terapeutici incentrati sulle vescicole extracellulari. Per iniziare, disponi i campioni biologici e un chip di tetraspanina sull'area di lavoro.
Pipettare 70 microlitri di campioni biologici umani che sono stati premiscelati con la soluzione B di un kit di tetraspanina umana su un chip. Posizionare la pellicola su una piastra di lavaggio dei trucioli per evitare l'evaporazione del campione. Dopo 16 ore, posizionare la piastra nella lavatrice per trucioli.
Bloccarlo in posizione e chiudere il coperchio. Premere l'opzione CW-TETRA v0 sulla rondella trucioli. Durante il lavaggio delle patatine, preparare 300 microlitri di soluzione bloccante per patatina.
Aggiungere 0,6 microlitri di ciascun anticorpo per chip alla soluzione bloccante. Agitare la soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi per garantire una miscelazione accurata. Al termine del lavaggio dei trucioli, aggiungere 250 microlitri di soluzione bloccante con il cocktail di anticorpi sopra ogni chip.
Quindi chiudere il coperchio e premere Continua. Quando la rondella dei trucioli emette un segnale acustico, rimuovere la piastra di lavaggio dei trucioli. Sposta le fiches su per la rampa.
Riposizionare la piastra nella rondella per trucioli, assicurandosi che si blocchi saldamente in posizione. Chiudere il coperchio e premere Continua. Per iniziare, accendi un analizzatore di nanoparticelle.
Avviare il programma software di scansione sul desktop collegato all'analizzatore di nanoparticelle. Selezionare la cartella dei trucioli per scegliere ogni truciolo di tetraspanina e posizionarlo nella posizione del truciolo sul mandrino. Fare clic sui tre quadrati sotto la posizione del chip per attivare la fluorescenza.
I quadrati diventeranno gialli, blu e rossi. Premere sul coperchio del mandrino e tirarlo per rimuoverlo. Quindi fissare saldamente i chip di tetraspanina caricati con campione sul mandrino.
Allineare i pioli del coperchio del mandrino con i fori e premere verso il basso. Far scorrere il coperchio per bloccarlo in posizione. Quindi posizionare il mandrino sul tavolino e bloccarlo in posizione.
Quindi, fai clic su Scansiona chip dall'interfaccia del software, quindi fai clic su OK. Una volta che il tavolino si sposta completamente all'interno della macchina, chiudere lo sportello. Al termine della scansione, aprire lo sportello per espellere il tavolino e verificare i risultati. Se le scansioni sono andate a buon fine, scartare le fiches.
Posiziona la prossima serie di chip sul mandrino. In alternativa, riportare il mandrino vuoto sul tavolino. Uscire dal software e spegnere la macchina al termine.
Livelli ottimali di fluorescenza delle vescicole extracellulari sono stati osservati nei canali CD63, CD81 e CD9, mentre il canale di controllo MIgG è rimasto nero, confermando la specificità del controllo. Il CD81 è stato ridotto per i fluidi biologici. L'assenza di fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9 è indicativa di un'assenza di vescicole extracellulari.
Lasovrasaturazione della fluorescenza era evidente, rendendo difficile discernere dati significativi a causa dell'eccessiva marcatura, in particolare nei canali CD63, CD81 e CD9.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo per la caratterizzazione di vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici umani, come le lacrime e la saliva. Utilizzando un chip a base di tetraspanina, l'approccio consente l'analisi delle EV a partire da volumi minimi di campione, favorendo lo studio di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio delle malattie.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Vescicole extracellulari
- Biomarcatori non invasivi
- Malattie oculari
Sfondo
- Le VV fungono da indicatori dello stato fisiologico e delle patologie
- Le difficoltà includono basse concentrazioni in campioni di piccole dimensioni e il tempo richiesto per l'elaborazione dei campioni
- L'importanza della diagnosi precoce dei disturbi corneali
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un chip a tetraspanina per l'analisi delle EV
- Campioni biologici umani (lacrime)
- Rilevamento basato sulla fluorescenza dei marcatori delle EV CD63, CD81 e CD9
Risultati principali
- L'integrazione dei passaggi di preparazione e analisi del campione riduce il tempo di elaborazione
- I livelli di fluorescenza dei marcatori di EV hanno confermato specificità e presenza
- Identificazione delle firme di EVt in campioni di lacrime provenienti da soggetti con cheratocono
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio semplificato all'analisi degli EV da campioni biologici di piccole dimensioni
- I risultati supportano futuri approcci diagnostici e bersagli terapeutici nella salute oculare
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
La caratterizzazione di vescicole extracellulari (EV) a partire da volumi minimi di fluidi biologici affronta un collo di bottiglia fondamentale nella scoperta di biomarcatori non invasivi e nel monitoraggio delle malattie. Questo flusso di lavoro consente la fenotipizzazione ad alto contenuto di EV a partire da campioni paziente scarsi, sostenendo la ricerca traslazionale e la validazione precoce di bersagli. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nelle decisioni di portafoglio basate su biomarcatori nei percorsi di sviluppo di farmaci per malattie oculari e sistemiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi di biomarcatori basati su EV per lo studio di percorsi biologici rilevanti per le malattie.
- Permette la validazione funzionale di target quantificando i fenotipi degli EV presenti nei fluidi derivati dai pazienti.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando le firme degli EV a stati fisiologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di rilevamento di EV validati per flussi di lavoro di screening successivi.
- Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili dei marcatori di EV a partire da appena 1 μL di campione.
- Standardizza le condizioni del saggio per ridurre al minimo la perdita di campione e massimizzare la qualità dei dati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea l'analisi non invasiva dei biomarcatori EV alle strategie di monitoraggio delle malattie.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante fluidi derivati dai pazienti.
- Supporta l'avanzamento basato sulla valutazione del rischio di ipotesi terapeutiche guidate da biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di caratterizzazione delle VP si inserisce nel percorso dallo sviluppo alla fase preclinica, collegando l'identificazione precoce di biomarcatori con la validazione traslazionale in contesti con campioni limitati.
- Biologia della Scoperta: Fornisce test di ipotesi robusti sulla rilevanza di biomarcatori in EV in condizioni patologiche.
- Screening: Offre letture quantitative e riproducibili dei marcatori di EV per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Fornisce dati su conteggio, dimensione e fenotipo delle particelle per confrontare condizioni biologiche.
- Ricerca Translazionale: Collega l'analisi di campioni non invasivi alla validazione preclinica di biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile per l'analisi di EV in diversi fluidi biologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella scoperta di biomarcatori negli EV e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Riduce i requisiti di campionamento e i tempi di elaborazione, migliorando al contempo la riproducibilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione per programmi guidati da biomarcatori e riduce i rischi nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle risorse per biomarcatori non invasivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella biologia degli EV e nei sistemi di rilevamento basati sulla fluorescenza.
- Necessita dell'accesso ad analizzatori di nanoparticelle e alla tecnologia di chip per tetraspanine.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la gestione dei campioni e l'interpretazione dei dati.
- Adattabile a diversi fluidi biologici con un'ottimizzazione del protocollo.
- I limiti potenziali includono la saturazione eccessiva del chip e le soglie di rilevamento del segnale.
