Name: Innervazione di organoidi intestinali umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri come innervare organoidi intestinali umani per studiare lo sviluppo del sistema nervoso enterico. Questo metodo combina segnalazione biochimica e forze biomeccaniche per migliorare la funzionalità tissutale.

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<ol><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (NEAA)</td><td>ThermoFischer Scientific 11140050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL provette coniche</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>"reagente per il distacco di cellule enzimatiche"</td></tr><tr><td>Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>per ENCC</td></tr><tr><td>Integratore B-27 (50x), senza siero</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>per</td></tr><tr><td>emacitometro HIO Bright-Line</td><td>Hausser</td><td>Scientific 3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Micropiastre con attacco ultrabasso</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto Corning a 24 pozzetti, trattata TC</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto Corning 3516 a 6 pozzetti</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2858501</td><td>Terreni alternativi per cellule staminali, utilizzati per piastre ENCC.</td></tr><tr><td>Pinza a punta fine</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>Thermo Scientific</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutagro, 200 mM, 100x</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFischer Scientific 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H9 ESC umano</td><td>Wicell International Stem Cell Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS Defined</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>LabGard Cabina di sicurezza biologica</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>Matrice a membrana basale Matrigel GFR, senza rosso fenolo,</td> senza <td>LDEV Corning</td><td>356231</td><td>"Matrice a membrana basale 3D trasparente"</td></tr><tr><td>Matrice qualificata Matrigel hESC,</td><td>Corning</td> senza LDEV <td>354277</td><td>"Matrice a membrana basale 3D"</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0,5-10, 0,1-2,5 uL)</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>"Stem cell media" Il numero di catalogo include il supplemento 5x, da aggiungere in blocco in anticipo.</td></tr><tr><td>Integratore N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>per HIO</td></tr><tr><td>Integratore N-2, CTS (Sistemi di Terapia Cellulare)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1370701</td><td>Per ENCC. Formulazione leggermente diversa.</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon DS-Fi2 TS-100</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Terreni condizionati con Noggin</td> Texas <td>Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di guida cellulare</td><td>ricombinante di activina A</td><td>umana GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante, CF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante FGF umano basico/FGF2 (146 aa)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>"Reagente per dissociazione di cellule staminali"</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge prive di RNASI, 2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFischer Scientific 11875093</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreni condizionati con R-spondina</td> Texas <td>Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542, Tocris Bioscience</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td> Standard Punte <td></td><td></td></tr> per <tr><td>pipettatore con orifizio largo</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecola Chir99021 in soluzione</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con filtro sterile</td><td>VWR (1000uL, 200uL, 10uL)</td><td>76322-154, 76322-150, 89174-520</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Matrice di membrana basale 3D alternativa, utilizzata per piastre ENCC.</td></tr></tbody></table>

innervazione di organoidi intestinali umani

Innervation of Human Intestinal Organoids

L'ENS regola le funzioni essenziali dell'intestino tenue maturo, tra cui la peristalsi, l'assorbimento dei nutrienti, il trasporto dei liquidi e il mantenimento della barriera epiteliale. Pertanto, l'obiettivo dell'innervazione degli HIO è quello di fornire a questi costrutti gli elementi necessari per sviluppare funzionalità più mature e di livello superiore. A tal fine, il nostro laboratorio studia in modo specifico lo sviluppo dell'ENS all'interno delle HIO e i risultati funzionali nelle diverse fasi.
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Innervazione di organoidi intestinali umani

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

La nostra ricerca si concentra sulla generazione di intestini ingegnerizzati come soluzione per la sindrome dell'intestino corto. Il nostro laboratorio si concentra sull'ottimizzazione dell'integrazione di un sistema nervoso enterico e sull'ottimizzazione dell'organizzazione spaziale, della diversità cellulare e della funzione. Speriamo che un giorno potremo creare una soluzione che cambi la vita ai bambini che soffrono di insufficienza intestinale creando un intestino bioingegnerizzato.Innervare gli organoidi intestinali umani richiede l'imitazione dello sviluppo intestinale umano e questo può essere difficile. Lo sviluppo del sistema nervoso enterico richiede sia la segnalazione biochimica che le forze biomeccaniche. Gli studi futuri del nostro laboratorio si concentrano sull'ottimizzazione dello sviluppo del sistema nervoso enterico all'interno di organoidi intestinali umani.Stiamo studiando l'organizzazione spaziale e la diversità cellulare e recentemente abbiamo utilizzato una nuova tecnica di imaging 3D sviluppata dal Dr. Herath in grado di caratterizzare e quantificare in modo robusto l'ENS all'interno dei nostri organoidi intestinali. Questo ci aiuterà a perfezionare il nostro modello e a ricapitolare lo sviluppo e la funzione intestinale umana. Innanzitutto, prendi la piastra del giorno 15-21 di cellule della cresta neurale enterica in coltura o sferoidi ENCC e rimuovi con cura il terreno dal pozzetto.Aggiungere un millilitro di un reagente caldo per il distacco di cellule enzimatiche nel pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi picchiettare il lato della piastra per facilitare la dissociazione degli sferoidi. Utilizzando una micropipetta P1000 con punta a bocca larga, titolare la miscela pipettandola delicatamente su e giù fino a ottenere un composto omogeneo di cellule.Trasferire la sospensione ENCC in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare il pozzetto con un millilitro di terreno cellulare caldo della cresta neurale per raccogliere eventuali cellule rimanenti, quindi aggiungerlo al tubo conico. Centrifugare ora la sospensione cellulare a 300 G per un minuto.Quindi aspirare il surnatante utilizzando un puntale per pipetta sterile. Successivamente, utilizzando una punta di pipetta a bocca larga, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno cellulare caldo della cresta neurale. Raccogliere gli sferoidi dell'intestino medio in coltura da tutti i pozzetti di una piastra di organoide intestinale umano utilizzando una punta di pipetta a bocca larga e trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri.Aggiungere il volume calcolato della sospensione ENCC nel tubo conico contenente gli sferoidi medio-posteriori. Utilizzando una punta per pipetta a bocca larga, tritare delicatamente la miscela per mescolare uniformemente gli sferoidi e gli ENCC. Centrifugare la sospensione di celle combinate a 300 G per un minuto.Aspirare con cura il surnatante utilizzando un puntale per pipetta sterile. Quindi risospendere il pellet cellulare risultante in una matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita freddo privo di fenolo. Successivamente, pipettare la goccia da 30 microlitri degli sferoidi dell'intestino medio-posteriore risospesi e degli ENCC nella matrice della membrana basale trasparente al centro di ciascun pozzetto asciutto.Una volta che tutte le goccioline sono state piastrate, coprire la piastra, capovolgerla e metterla in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Il giorno zero, una volta che la matrice della membrana basale trasparente si è polimerizzata, coprire ogni gocciolina con 500 microlitri di terreno caldo del giorno zero a tre terreni HIO. Il terzo giorno, aspirare con cura il terreno HIO del giorno zero o tre dal lato di ciascun pozzetto senza disturbare la gocciolina chiara della matrice della membrana basale.Sostituirlo con 500 microlitri di terreno HIO caldo dal terzo al giorno 14 e rimettere la piastra nell'incubatore. Il giorno 14, esaminare ogni pozzetto al microscopio per valutare il numero di strutture HIO+ENS in via di sviluppo in ogni gocciolina di matrice di membrana basale 3D trasparente. Aggiungere 30 microlitri di matrice di membrana basale trasparente alle provette da microcentrifuga da due millilitri e tenerle in ghiaccio.Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza fine per rimuovere con cura la gocciolina trasparente della matrice della membrana basale 3D contenente l'HIO+ENS sospeso. Separare delicatamente le singole strutture HIO+ENS utilizzando la pinza. Utilizzando una pinza fine o una punta per pipetta a bocca larga, posizionare ciascuna struttura HIO+ENS isolata nelle provette per microcentrifuga contenenti 30 microlitri di matrice di membrana basale trasparente.Quindi pipettare una goccia da 30 microlitri di HIO+ENS risospeso in una matrice di membrana basale trasparente al centro di ciascun pozzetto asciutto. Una volta che le goccioline si sono polimerizzate, aggiungere 500 microlitri di terreno caldo e fresco dal terzo giorno a 14 terreni HIO+ENS in ciascun pozzetto e incubare la piastra per una notte. Il giorno 15, aspirare con cura il terreno dal terzo al 14° giorno dal lato di ciascun pozzetto senza disturbare la gocciolina polimerizzata.Sostituire il supporto con 500 microlitri di terreno caldo giorno da 15 a 28 HIO+ENS. La cocoltura HIO-ENS ha mostrato una crescita significativa con lo sviluppo di strutture mesenchimali, formando proiezioni sottili e nebulose, creando un bordo simile a un alone attorno alle involuzioni epiteliali entro il giorno 30. Gli ENCC sono migrati verso gli HIO, integrati all'interno del mesenchima, e sono sopravvissuti in vitro, come dimostrato dalla fluorescenza GFP all'interno degli HIO, confermando un'adeguata sopravvivenza e segnali di differenziazione dal mesenchima.Le cocolture HIO+ENS trapiantate esprimevano marcatori neuronali, tra cui HuCD, e marcatori gliali come S100 beta dopo la crescita in vivo, confermando la differenziazione sia nei neuroni che nella glia.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video dimostra il metodo di creazione di organoidi nervosi motori coltivando prima cellule staminali pluripotenti indotte umane in un mezzo speciale per formare sferoidi, poi differenziandole in motoneuroni utilizzando inibitori specifici e infine coltivandole in un chip microfluidico per estendere gli assoni e formare organoidi nervosi motori.

Sviluppo di organoidi nervosi motori derivati da iPSC umane utilizzando un chip microfluidico

Questo protocollo consente la differenziazione delle cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali. Il protocollo imita il normale sviluppo umano differenziando le cellule in una popolazione di endoderma definitivo, endoderma dell'intestino posteriore e quindi epitelio intestinale. Ciò rende il protocollo adatto sia per lo studio dello sviluppo intestinale che per le applicazioni di modellizzazione delle malattie.

Generazione di organoidi intestinali derivati da hiPSC per applicazioni di modellizzazione dello sviluppo e delle malattie

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Qui vengono descritti metodi dettagliati per la generazione, il mantenimento e la caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Questi metodi sono progettati per migliorare la riproducibilità, espandere la scalabilità e ridurre il tempo di lavoro necessario per la placcatura e il passaggio degli organoidi.

Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

Il protocollo combina la tecnologia degli organoidi intestinali umani con l'analisi trascrittomica a singola cellula per fornire informazioni significative sulla biologia intestinale precedentemente inesplorata.

Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

La modellazione dello sviluppo del cervello umano è stata ostacolata a causa della complessità senza precedenti del tessuto epiteliale neurale. Qui viene descritto un metodo per la generazione robusta di organoidi cerebrali per delineare gli eventi precoci dello sviluppo del cervello umano e per modellare la microcefalia in vitro.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Scopri come innervare organoidi intestinali umani per studiare lo sviluppo del sistema nervoso enterico. Questo metodo combina segnalazione biochimica e forze biomeccaniche per migliorare la funzionalità tissutale.

Innervazione di organoidi intestinali umani

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