Quantificazione del comportamento di toelettatura di Drosophila melanogaster per la valutazione di fenotipi di toelettatura eccessivi

La nostra ricerca valuta i comportamenti di toelettatura in Drosophila melanogaster dopo knockdown di Atg8a mediato da RNAi per modellare i deficit di GABARAP osservati nei pazienti con sindrome di Tourette. Il nostro obiettivo è comprendere il ruolo di aAtg8a nello sviluppo comportamentale, fornendo approfondimenti sulle funzioni regolatorie della sua controparte umana nei processi neurocomportamentali. Le attuali sfide sperimentali con il metodo di annotazione manuale includono il complesso processo analitico, come l'annotazione e la revisione del metraggio, e la soggettività coinvolta nell'annotazione manuale.

Anche i metodi automatizzati devono affrontare sfide, tra cui la necessità di una notevole competenza informatica per essere implementati ed eseguiti in modo efficace. Abbiamo scoperto che il gene Atg8a svolge un ruolo nello sviluppo del comportamento nei moscerini della frutta al di là di quanto precedentemente stabilito. Più specificamente, abbiamo scoperto che regola sia la toelettatura che l'apprendimento, suggerendo che gli ortologhi Atg8a possono svolgere ruoli simili in altri organismi.

Questa tecnica consente la quantificazione diretta della frequenza e della distribuzione della toelettatura in Drosophila. È particolarmente utile nei laboratori che non sono in grado di utilizzare metodi automatizzati e consente un'analisi più dettagliata rispetto ai metodi indiretti basati su coloranti. Nel complesso, la nostra ricerca avanza l'uso della Drosophila come organismo modello per lo studio dei disturbi dello sviluppo neurologico che mostrano un comportamento ossessivo-compulsivo come la sindrome di Tourette.

Si aggiunge anche alla crescente evidenza che le proteine correlate all'autofagia svolgono un ruolo nello sviluppo comportamentale. Per iniziare, posiziona quattro piatti a tre pozzetti uno accanto all'altro su una superficie bianca e copri ogni piatto con un vetrino. Posiziona una fotocamera sopra i piatti.

Assicurarsi che non vi siano riflessi sui vetrini che potrebbero limitare la visibilità delle mosche nel piatto e regolare la posizione della piastra o attenuare le luci secondo necessità per eliminare l'abbagliamento. Ora segna la posizione delle stoviglie e della telecamera sulla panca dove sta avvenendo la registrazione. Posiziona le mosche di quattro-nove giorni su un blocco di ghiaccio coperto di parafilm e un tovagliolo di carta per anestetizzarle leggermente.

Una volta anestetizzate, spostare le mosche nelle camere di osservazione il più rapidamente possibile utilizzando un pennello. Posizionare una mosca in ciascun pozzetto del piatto a tre pozzetti, assicurando il minimo disturbo per evitare di provocare cambiamenti comportamentali indotti dallo stress. Dopo aver acclimatato i moscerini 30 minuti dopo l'anestesia, registrare i moscerini utilizzando una fotocamera, quindi aprire il terminale e digitare cd PiSpy.

Digita python3 PiSpy. py, e inserire la lunghezza di registrazione e la frequenza dei fotogrammi desiderate. Seleziona la risoluzione desiderata e fai clic su Acquisizione rapida.

Ora usa la funzione Anteprima fotocamera in Pi Spy per assicurarti che le mosche siano a fuoco e sufficientemente visibili. Registra le mosche per 10 minuti a una frequenza di fotogrammi consigliata di 24 fotogrammi al secondo e salva il file. Per analizzare il video, importa il file nel software ELAN 6.8 per un'annotazione dettagliata e un'analisi approfondita dei comportamenti di toelettatura.

Seleziona Livello, Aggiungi nuovo livello, digita la posizione nel piatto nel nome del livello e aggiungi per assegnare ogni riga per annotare manualmente il filmato delle persone. Per annotare i comportamenti, fare doppio clic sul livello da annotare, fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare il cursore lungo il livello selezionato per un periodo durante il quale viene esibito un singolo attacco di adescamento. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per selezionare la nuova annotazione e fare doppio clic sul periodo di tempo appena evidenziato per digitare l'abbreviazione per il comportamento osservato in quel momento.

Una volta che il video è completamente annotato, ottieni una ripartizione di ciascun comportamento facendo clic su Visualizza, seguito da Statistiche di annotazione. Identificare la toelettatura anteriore come la toelettatura eseguita nella regione anteriore del corpo del moscerino. Identificare la toelettatura posteriore come la toelettatura eseguita all'estremità antero-posteriore del corpo della mosca.

Gli attacchi di toelettatura sono aumentati significativamente nei mutanti Atg8a RNAi rispetto ai gruppi di controllo. Anche il tempo trascorso nella toelettatura era significativamente elevato nei mutanti Atg8a RNAi rispetto ai controlli. Non sono state osservate differenze significative nella distribuzione dei comportamenti di grooming anteriori rispetto a quelli posteriori.