Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

Questo studio ha confrontato visivamente la distribuzione spaziale e temporale dei geni microbici chiave del ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale, esplora come i fattori ambientali regolano le dinamiche del metano. I nostri risultati rivelano che l'abbondanza di geni del ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale è sensibile alle condizioni ambientali, tra cui la salinità e la stagione. In particolare mmoX, un tipo di gene della metano monoossigenasi, è più abbondante nelle stagioni più fredde.

Questo protocollo si rivolge alla ricerca per rilevare i geni microbici del ciclo del metano offrendo nuovi strumenti per visualizzare le dinamiche microbiche spaziali e stagionali influenzate da fattori ambientali. Integrando metodi PCR ottimizzati con la visualizzazione GIS, questo protocollo fornisce un rilevamento avanzato e una mappatura spaziale dei geni del ciclo del metano, acquisendo al contempo modelli microbici dinamici, spaziali e stagionali influenzati da fattori ambientali.

[Narratore] Per iniziare, preparare una miscela di reazione cPCR da 25 microlitri con l'eDNA e altri componenti. Posizionare le provette nella macchina PCR ed eseguire la reazione cPCR con i parametri appropriati. Dopo la cPCR, preparare la miscela di reazione qPCR contenente cyber green, escluso il DNA stampo. Erogare 57 microlitri della miscela di reazione preparata in ciascuna provetta per PCR. Aggiungere 3 microlitri di DNA stampo, acqua standard o priva di nucleasi a ciascuna provetta e picchiettare delicatamente la provetta per mescolare. Aliquotare 20 microlitri della miscela di reazione preparata da ciascuna provetta in appositi pozzetti di una piastra qPCR a 96 pozzetti. Sigillare la piastra PCR con una pellicola sigillante adesiva PCR utilizzando un applicatore. Centrifugare a 1.000 x g per un minuto per garantire una corretta miscelazione ed eliminare eventuali bolle all'interno dei pozzetti. Posizionare la piastra PCR nel termociclatore. Accendere la macchina qPCR e aprire il relativo software per impostare il protocollo. Impostare il programma qPCR e avviare l'esecuzione. Aprire il software del sistema informativo geografico, ArcGIS Pro, e salvare il file di progetto con il nome Area di studio nella cartella specificata sul computer. Fare clic su Mappa, quindi selezionare Mappa di base e scegliere il terreno con etichette come mappa di base. Fare clic su Individua, quindi fare clic su Cerca. Quando si apre la barra di ricerca, digita il nome dell'area di studio per localizzarla sulla mappa. Per disegnare l'area specifica utilizzando la georeferenziazione, fare clic su Visualizza, quindi su Riquadro catalogo dal livello superiore. Fare doppio clic sulla cartella dal catalogo e selezionare il nome del file desiderato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file .gdb del database geografico. Fare clic su Nuovo e selezionare Classe di entità geografiche. Verrà quindi visualizzata la finestra Crea classe di entità geografiche. Digita la casella Nome e alias e fai clic su Fine in basso. Ora, fai clic su Visualizza, seguito da Contenuti. Il nome dell'alias verrà visualizzato nel riquadro Contenuti. Fare clic su Modifica dal livello superiore, quindi su Crea. Verrà visualizzato il riquadro Crea funzionalità. Fare doppio clic sull'alias nel riquadro Crea funzionalità per visualizzare le opzioni Configura feedback strumento. Selezionare le linee, quindi disegnare le linee sulla mappa per creare il confine dell'area di studio. Fare doppio clic sulla mappa per terminare. Riduci a icona il software GIS e apri un foglio di calcolo. Digitare il nome del campione nella prima colonna, la latitudine nella seconda colonna e la longitudine nella terza colonna. Utilizzare le quattro colonne successive per i dati qPCR di pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA. Salvare il file in formato CSV in una cartella specifica sul computer. Quindi, apri il software GIS e fai clic su Aggiungi dati, seguito da Dati punto XY. Selezionare il file CSV salvato dalla cartella nella casella Tabella di input. Rinominare il file nella casella Classe entità geografiche di output e fare clic su Esegui per visualizzare i punti di campionamento sulla mappa. Ora, fai clic sulla barra di ricerca in alto e cerca Kriging. Selezionare il file della stazione di campionamento e scegliere pmoA1. Quindi fare clic sull'ambiente, selezionare la stazione di campionamento nel layer e nella maschera e fare clic su Esegui. Per creare un layout della mappa, fare clic su Inserisci, Nuovo layout e selezionare ANSI-Landscape. Fare clic su Cornice mappa, selezionare la mappa con kriging e posizionare tutte le mappe nel layout disegnando rettangoli. Seleziona Freccia nord e posizionala nel layout per indicare la direzione nord. Quindi selezionare Barra scala per visualizzare la scala dell'area sulla mappa. Fare clic su Legenda, quindi posizionarlo nel layout per visualizzare le legende della mappa. Fare clic su Griglia, quindi selezionare qualsiasi opzione di reticolo nero per creare una griglia con latitudine e longitudine. La griglia apparirà nel riquadro Contenuti con l'etichetta Reticolo orizzontale nero dell'etichetta. Fare doppio clic su Reticolo orizzontale nero dell'etichetta, selezionare Componenti e rimuovere i segni di spunta 1 e Griglia facendo clic sul segno di croce alla loro destra. Infine, fai clic su Condividi dal livello superiore, quindi fai clic su Esporta layout. Selezionare il tipo di file come PDF, salvare il file sul computer utilizzando la casella Nome, impostare la risoluzione verticale su 500 DPI e fare clic su Esporta per creare il file PDF della mappa. L'analisi cPCR ha rivelato variabilità spaziale nel rilevamento dei geni correlati al ciclo del metano, con i geni mcrA rilevati in tutti i campioni LB e RV, ma assenti nei campioni BC, collegando la salinità alla distribuzione del metanogeno. La cPCR ha mostrato bande più luminose per pmoA1 con coppie di primer A189-mb661, confermando un'abbondanza bassa ma rilevabile nei campioni RV, mentre era assente in LB e BC. L'analisi qPCR ha mostrato un'elevata variazione stagionale, con i geni mmoX più abbondanti durante la stagione fredda e pmoA1 più abbondanti durante la stagione calda.