Name: Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Scopri come rilevare il blebbing nucleare e la perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza. Questo metodo utilizza cellule HeLa per studiare i meccanismi di riparazione del DNA nelle laminopatie.

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<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
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<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
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</ol>

La lamina nucleare è una rete di filamenti che sta alla base della membrana nucleare ed è costituita da proteine chiamate lamine. La lamina nucleare svolge un ruolo essenziale nell'architettura nucleare, nel posizionamento dei pori nucleari, nella regolazione dell'espressione genica, nell'organizzazione della cromatina, nella replicazione del DNA e nella riparazione del DNA 1,2,3. Le mutazioni nei geni che svolgono un ruolo nell'espressione delle proteine della lamina portano a malattie genetiche chiamate laminopatie3.
La dermopatia restrittiva (RD) è una grave malattia della laminopatia prevalentemente causata da mutazioni eterozigoti composte che creano codoni di terminazione prematura nel gene ZMPSTE24 4, portando all'assenza della metalloproteasi ZMPSTE24. Questa laminopatia è caratterizzata da ritardo della crescita intrauterina, pelle tesa e rigida, bocca di piccole dimensioni, capelli sottili e difetti di mineralizzazione ossea1. I pazienti con RD di solito non superano la prima settimana di vita a causa dell'insufficienza polmonare1. Altri due disturbi della laminopatia noti come sindrome di Hutchinson-Gilford Progeria atipica (AT-HGPS) e displasia mandibuloacrale di tipo B (MAD-B) comportano una ridotta espressione ZMPSTE24 e sono associati a una ridotta durata della vita e mostrano somiglianze con i disturbi dell'invecchiamento precoce5. La proteasi ZMPSTE24 che viene influenzata in queste laminopatie è vitale nella modifica post-traduzionale della lamina A, che è un componente critico della lamina nucleare. ZMPSTE24 carenza provoca l'accumulo di una forma farnesilata non completamente elaborata di lamina A, nota come prelamina A2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Figura 1: Elaborazione della lamina A in condizioni normali vs. Cellule RD. Via di elaborazione della lamina A nelle cellule normali (a sinistra) e elaborazione alterata della lamina A nelle cellule RD o carenti di ZMPSTE (a destra). Sono indicati i gruppi farnesil (Fa) e metile (Me). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come si vede nella Figura 1, nel normale processo della lamina A, un gruppo farnesilico (lipidico) è attaccato a un residuo di cisteina vicino al C-terminale, seguito dalla scissione proteolitica di tre amminoacidi C-terminali 3,6. Il residuo di cisteina viene quindi metilato. Queste due modifiche consentono alla prelamina A di essere indirizzata alla membrana nucleare interna2. ZMPSTE24 quindi esegue una reazione di scissione in cui gli ultimi 15 amminoacidi C-terminali, insieme ai gruppi farnesil e metilico, vengono rimossi per produrre la proteina matura della lamina A, che viene consegnata alla lamina nucleare 6,7,8. Nella RD, AT-HGPS e MAD-B, la fase finale del processamento non avviene in modo efficace poiché la ZMPSTE24 metalloproteinasi è carente o non completamente funzionante 8,9. Ciò si traduce nell'accumulo di prelamina A, che rimane permanentemente farnesilata e metilata9. Questi ultimi gruppi fanno sì che la prelamina A si attacchi alla membrana nucleare interna invece di localizzarsi nella lamina nucleare, dove la lamina A matura dovrebbe infine risiedere, come si vede nella Figura 1. Pertanto, la carenza di ZMPSTE ha effetti profondi su una varietà di funzioni nucleari, insieme alla struttura nucleare10,11,12,13,14,15. Queste alterazioni della struttura nucleare possono includere il blebbing nucleare e persino la rottura nucleare che può provocare la fuoriuscita di DNA nel citosol e l'ingresso di citosol nel nucleo. I nuclei di forma aberrante sono infatti un segno distintivo dei disturbi della laminopatia, insieme a numerosi altri fenotipi causati da un difetto del trattamento della prelamina A16,17. I difetti nella lamina nucleare portano a una moltitudine di impatti dannosi, tra cui l'errata localizzazione del controllo di qualità delle proteine nucleari e delle proteine di riparazione del DNA nel nucleoplasma, che, a sua volta, si traduce in numerosi difetti nella funzione nucleare18. È importante disporre di una tecnica semplice che possa aiutare a identificare e monitorare questi segni distintivi delle laminopatie per facilitare la ricerca sullo sviluppo di approcci terapeutici volti a migliorare i fenotipi della laminopatia. Per i topi con laminopatie, è stato dimostrato che l'eliminazione del blebbing nucleare è correlata con l'eliminazione generalizzata dei fenotipi di laminopatia16. Una tecnica che consente il monitoraggio dell'integrità nucleare nelle cellule umane potrebbe migliorare lo studio di potenziali trattamenti per eliminare o migliorare significativamente i fenotipi della malattia.
L'immunofluorescenza indiretta (IF) è una tecnica sensibile e ampiamente utilizzata che utilizza sia un anticorpo primario non marcato che un anticorpo secondario marcato con fluoroforo che riconosce l'anticorpo primario per rilevare un bersaglio di interesse19. I metodi IF possono fornire un potente mezzo per visualizzare specifici componenti e strutture intracellulari. È anche possibile che più di una molecola di anticorpo secondario possa interagire con l'anticorpo primario, con conseguente amplificazione del segnale19. L'IF indiretta è una tecnica versatile che consente anche la rilevazione di più anticorpi primari con un insieme relativamente piccolo di anticorpi secondari poiché gli anticorpi secondari vengono sollevati contro il dominio Fc dell'anticorpo primario, che è conservato all'interno della specie19.
Questo articolo descrive un metodo indiretto (IF) per valutare il blebbing nucleare e la perdita di DNA in cellule carenti di ZMPSTE24, utilizzando anticorpi contro il DNA a doppio filamento (dsDNA) e la lamina B1 per rilevare rispettivamente il DNA e la lamina nucleare. Per dimostrare l'utilità di questo approccio, la procedura è stata applicata a una linea cellulare HeLa con espressione ZMPSTE24 knocked-out, nonché a una linea cellulare HeLa che esprime ZMPSTE24, e sono stati confrontati i risultati per le due linee cellulari.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti quadrati da 22 mm</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>Qualsiasi dimensione o forma può essere utilizzata purché possa essere fissata a un vetrino da microscopio standard.</td></tr><tr><td>36,5% Formaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Reagente di fissazione.</td></tr><tr><td>75 cm 2 Palloni</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Siero bovino Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Tampone di diluizione degli anticorpi.</td></tr><tr><td>DMEM con 1 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Etanolo (200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Per la disidratazione dei campioni prima del montaggio, diluito per ottenere concentrazioni multiple.</td></tr><tr><td>EVOS FL Microscopio digitale a fluorescenza invertita</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Imaging.</td></tr><tr><td>Gelatina di pesce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Tampone di diluizione degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Mezzo di montaggio per prevenire il fotosbiancamento.</td></tr><tr><td>Parafilm (4 pollici)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Qualsiasi dimensione può essere sostituita, purché i vetrini coprioggetti utilizzati possano adattarsi.</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prodotto e sterilizzato in laboratorio per colture e soluzioni tissutali.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino premium (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi vetrino per microscopio standard.</td></tr><tr><td>Piastre a fondo piatto a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>per la coltura cellulare.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Per il lavaggio.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Reagente per permeazione cellulare.</td></tr></tbody></table>

rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di dna nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Questo studio introduce un metodo IF per visualizzare la lamina nucleare in combinazione con il DNA a doppio filamento (dsDNA). Una volta eseguita l'IF, le immagini acquisite possono essere esaminate alla ricerca di segni di blebbing nucleare e perdita di DNA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Figura 2: Blebbing nucleare nelle cellule HeLa C...

Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

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