Imaging dei segnali Ca²⁺ in piccole vene polmonari a pressioni intraluminali fisiologiche

In questo protocollo, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione e l'analisi dei segnali di Ca²⁺ nelle vene intrapolmonari (piccole vene polmonari o PV) a pressioni intraluminali fisiologiche. La tecnica prevede l'isolamento di piccoli PV, l'incubazione con un indicatore di Ca²⁺ , l'incannulamento e la pressurizzazione, l'imaging confocale dei segnali di Ca²⁺ e l'analisi dei dati.

I segnali del calcio regolano la funzione dei vasi sanguigni, variando nella fonte e nel ruolo. Il nostro obiettivo è comprendere le loro funzioni specifiche nella parete vascolare e identificare le anomalie legate alla malattia. La maggior parte degli studi sui vasi sanguigni polmonari si concentra sulle arterie o sui capillari, non sulle vene polmonari.

Nessuno studio ha esaminato i segnali del calcio nelle vene polmonari sotto normali pressioni intraluminali, nonostante la loro rilevanza fisiologica. Le vene polmonari subiscono variazioni di pressione durante i cicli cardio, ma il loro impatto sui segnali del calcio non è stato studiato. Il nostro protocollo consente l'acquisizione e l'analisi automatica dei segnali del calcio nelle piccole vene polmonari a pressione normale.

Il nostro protocollo consente studi futuri su come la pressione intraluminale influisce sui segnali del calcio nelle piccole vene polmonari, migliorando la comprensione della loro regolazione e del loro ruolo nella salute e nella malattia. Per iniziare, pulire gli strumenti di dissezione e le stoviglie in etanolo al 100%, quindi lavarli in acqua deionizzata. Con un paio di forbici.

Aprire la cavità toracica di un topo soppresso. Usa una pinza per rimuovere con cura il cuore e i polmoni dalla cavità toracica con il minimo contatto con i polmoni. Quindi, posizionare il tessuto su una piastra rivestita di protezione della tenuta contenente una soluzione salina fisiologica tamponata HEPES fredda.

Fissare il cuore e i polmoni utilizzando perni di dissezione in modo che le grandi vene polmonari e le arterie polmonari siano chiaramente visibili e il lobo sinistro del polmone sia leggermente allungato. Utilizzando le grandi vene polmonari come punti di riferimento, rimuovere con cura il tessuto che circonda le piccole vene interpolmonari con l'aiuto di forbici sottili. Quindi isolare delicatamente le piccole vene polmonari dal tessuto circostante.

Successivamente, preparare una concentrazione madre di 2,5 millimolari di Fluo-4 AM con DMSO. Utilizzando la soluzione madre, preparare la soluzione di carico. Mettere le piccole vene polmonari in una provetta da 1,5 millilitri con la soluzione di carico.

Coprire la provetta con un foglio di alluminio, incubata a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un'ora. Per incannulare le piccole vene polmonari, rimuovere una vena dalla soluzione di lavaggio. Metterlo in una camera di miografia a pressione preparata.

Con un paio di pinze a punta fine, incannulare con cura un'estremità della piccola vena polmonare su una delle cannule, quindi utilizzare un microfilamento di filo di nylon per fare un nodo attorno all'estremità cannulata della piccola vena polmonare e alla punta della cannula per fissarla. Spingere delicatamente la soluzione salina fisiologica attraverso la cannula per rimuovere il sangue all'interno della vena polmonare. Usa il filo di nylon per legare l'altra estremità con una cannula di vetro usando micro filamenti.

Per l'imaging del calcio, collegare prima un servoregolatore di pressione a un tubo contenente una soluzione salina fisiologica tamponata HEPES. Utilizzare il controller per pressurizzare la piccola vena polmonare da un'estremità. Collegare ora una pompa peristaltica a un ingresso, un'uscita e un'uscita e sovrafondere la soluzione.

Dopo il periodo di equilibratura, utilizzare l'obiettivo a immersione in acqua 40x e un sistema di imaging confocale a disco rotante per acquisire immagini del calcio per 1.000 fotogrammi. Per eseguire l'analisi delle immagini, avviare Spark e il software progettati su misura. Usa il filtro cinque per cinque e il filtro mediano per uniformare le immagini, seguiti da un fotogramma che delinea una regione piatta della vena polmonare con più celle per il rilevamento automatico degli eventi.

Fare clic su Visualizza e Rilevamento automatico eventi. Imposta la soglia dell'evento su un'ampiezza di 1,3 F su F0, la tolleranza al 20% della casella di scansione su sette pixel per sette e la media corrente su sette immagini. Fare clic su Avvia ricerca o sull'icona a forma di occhio.

Trova la tabella degli eventi facendo clic sulla tabella degli eventi piccoli nel menu di visualizzazione, quindi calcola gli eventi per quadrato micrometrico dividendo il numero di segnali di ioni calcio rilevati per l'area del fotogramma selezionato. Il numero di segnali di calcio che si verificano spontaneamente nelle piccole vene polmonari a cinque millimetri di pressione intraluminale del mercurio era di 0,73 più o meno 0,2 eventi al minuto per micrometro quadrato in condizioni basali. L'aggiunta di rianodina ha ridotto drasticamente l'attività di segnalazione del calcio.