In vitro Test della trombosi per dispositivi di assistenza ventricolare

Presentiamo un protocollo da banco per indurre la trombosi nei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) all'interno di una piattaforma di test a ricircolo. Questo metodo serve a identificare i punti caldi trombogenici nel percorso del flusso sanguigno e può aiutare a migliorare la tromboresistenza prima dei test preclinici su modelli animali.

Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un protocollo da banco pratico e accessibile per identificare potenziali hotspot trombogenici nei dispositivi di assistenza ventricolare, colmando il divario critico tra la prototipazione precoce e la sperimentazione animale. La sperimentazione animale è rimasta il metodo principale per valutare la trombosi nei dispositivi di assistenza ventricolare. Sebbene la fluidodinamica computazionale sia diventata uno strumento inestimabile per la verifica dei progetti, non può ancora soppiantare la convalida in vitro e in vivo.

La natura complessa della presenza di coagulazione del sangue e numerosi fattori confondenti, rendono difficile distinguere tra la trombogenicità effettiva del dispositivo e gli artefatti sperimentali. I metodi in vitro per la valutazione della trombosi nei VAD rimangono sottoutilizzati e ad oggi non esiste alcun metodo standardizzato. Offrendo un protocollo completo e una guida video, speriamo di facilitare una più ampia adozione dei metodi da banco.

Questo metodo affronta una sfida sia tecnica che etica nello sviluppo di dispositivi medici, riducendo la dipendenza dai test sugli animali e migliorando al contempo la capacità di rilevare i rischi di trombosi nelle prime fasi del processo di sviluppo. Per iniziare, riempi il ciclo del test con 150 millilitri di sangue. Elimina tutta l'aria intrappolata nel circuito.

Se si utilizza una pompa del sangue a flusso assiale, ruotarla in posizione verticale per rilasciare l'aria tramite galleggiamento. Se si utilizza una pompa centrifuga, capovolgerla e ruotarla per assicurarsi che l'aria non rimanga intrappolata nei percorsi del flusso secondario. Picchiettare delicatamente le superfici dei tubi e del serbatoio e spremere eventuali bolle d'aria per rimuoverle.

Ispezionare attentamente le sezioni orizzontali dei tubi e le giunzioni tra tubi e connettori per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Spremere la sacca endovenosa per avvicinare il livello del liquido alla parte superiore stretta. Quindi bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido per eliminare l'interfaccia fluido-aria e chiudere il rubinetto di sfiato dell'aria.

Quindi, chiudere il rubinetto all'estremità delle linee di pressione. Rimuovere il tubo del manometro e collegare una siringa da tre millilitri. Aprire il rubinetto e aspirare da uno a due millilitri di liquido nella linea di prolunga, circa quattro centimetri.

Chiudere il rubinetto, staccare la siringa e ricollegare il tubo del manometro. Aprire il rubinetto per abilitare le letture della pressione. Infine, adescare la porta di campionamento utilizzando una siringa.

Quindi, taglia o strappa una salvietta priva di lanugine in tre frammenti uguali. Ruotare l'angolo di un frammento per formare una punta e inserirlo nella porta di iniezione per assorbire il sangue residuo. Ruota il secondo frammento.

Inumidiscilo con soluzione fisiologica e inserisci la punta bagnata nella porta per rimuovere tutto il sangue rimanente. Utilizzare il terzo frammento per assorbire l'eventuale soluzione salina residua nella porta. Ora avvia il dispositivo di assistenza ventricolare, o VAD, a bassa velocità e azionalo per circa cinque secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno della pompa.

Arrestare la pompa. Se compaiono delle bolle nel sacchetto, ripetere la disaerazione. Riavviare la pompa a bassa velocità per far circolare il sangue nel circuito.

Trasferire un millilitro di eparina sodica, due millilitri della soluzione di cloruro di calcio preparata e 1,5 millilitri di EDTA in provette separate. Per aggiungere eparina al sangue nell'ansa, aspirare 75 unità di eparina in una micropipetta e dispensarla in una siringa da tre millilitri dispensando contemporaneamente la pipetta e aspirando lo stantuffo della siringa senza fuoriuscire. Utilizzare la porta trasversale del rubinetto a tre vie per somministrare le sostanze nell'ansa con una siringa.

Ruotare il blocco dell'esca maschile sul rubinetto in modo che la porta di iniezione sia rivolta verso l'alto per intrappolare le bolle d'aria nella parte superiore. Ora collega la siringa alla porta di iniezione tramite il blocco dell'esca con la porta rivolta verso l'alto e la siringa rivolta verticalmente verso il basso. Aspirare lo stantuffo della siringa per riempirla di sangue e mescolare l'eparina con il sangue aspirando l'aria nella siringa.

Lasciare che le bolle d'aria salgano verso l'alto della siringa. Quindi iniettare la miscela nel circuito, assicurandosi che non entri aria. Far entrare e uscire il sangue dalla siringa quattro o cinque volte per assicurarsi che il sangue eparinizzato non rimanga confinato nello spazio della porta.

Per titolare il tempo di coagulazione attivato, o ACT, del sangue nell'ansa, aggiungere prima 750 microlitri di soluzione di cloruro di calcio monomolare a 150 millilitri di sangue nell'ansa. Per prevenire la coagulazione del sangue, iniettare rapidamente il fluido dopo aver rimosso l'aria residua. In alternativa, diluire il cloruro di calcio nella siringa con un millilitro di soluzione fisiologica tamponata per ridurre la coagulazione prematura.

Dopo aver lasciato circolare il cloruro di calcio iniettato per almeno due minuti, collegare una siringa da un millilitro alla porta di campionamento. Prelevare e scartare 0,5 millilitri di sangue di scarto per eliminare il sangue stagnante dalla porta. Quindi, collegare una nuova siringa da un millilitro alla porta di campionamento e prelevare 0,5 millilitri di sangue per l'analisi.

Misurare il tempo di coagulazione attivato utilizzando un sistema di coagulazione del sangue intero point-of-care. Pulire la porta di campionamento utilizzando salviette prive di lanugine come dimostrato in precedenza. Fare riferimento ai valori di titolazione per indicare la concentrazione target di cloruro di calcio.

Aumentare in modo incrementale la concentrazione di calcio per ottenere un tempo di coagulazione attivato di 300 secondi. Iniziare il test di trombosi in vitro una volta raggiunto l'ACT di 300 secondi nel ciclo. Regolare la pompa alla portata e alla pressione desiderate modificando la velocità del rotore e regolando la resistenza utilizzando la fascetta Hoffman.

Misurare l'ACT ogni 15 minuti prelevando un campione di sangue dall'ansa e inserendo una goccia di sangue nello strumento ACT, come dimostrato in precedenza. Se l'ACT scende al di sotto di 200 secondi, iniettare altre 25 unità di eparina sodica nel circuito. Dopo un'ora, iniettare 1,5 millilitri di EDTA 0,5 molari nell'ansa per inibire l'ulteriore coagulazione.

Lasciare circolare l'EDTA e mescolare per due minuti, quindi arrestare la pompa. Utilizzando gli emostatici, clamp il tubo collegato all'ingresso e all'uscita della pompa, posizionando i clamps a tre o quattro centimetri di distanza dalle punte di ingresso e uscita. Scollegare con cautela il tubo per rilasciare la pompa.

Quindi drenare il sangue dalla pompa e il circuito di flusso in un contenitore. Infine, pipettare la soluzione fisiologica attraverso l'ingresso e l'uscita della pompa per lavare il sangue residuo. La deposizione piastrinica è stata costantemente osservata lungo le radici delle pale nei prototipi di pompa.

L'elettrolucidatura dei componenti in titanio ha eliminato la formazione di trombi su queste aree. Il prototipo presentava anche una cooptazione imperfetta nella giunzione dei componenti dell'alloggiamento anteriore e posteriore, con conseguente fessura in cui il sangue penetrava e si coagulava. La lappatura e la lucidatura hanno migliorato l'adattamento dei componenti e ridotto la formazione di trombi.

Errori procedurali e de-airing incompleto del ciclo possono introdurre artefatti. In questo caso, un errore sperimentale durante l'iniezione di cloruro di calcio ha innescato una coagulazione localizzata e il trombo risultante è entrato nella pompa centrifuga Maglev, occludendo il percorso del flusso. I coaguli sferici, che aderiscono in modo lasco, osservati sulle superfici, sono spesso il risultato di bolle d'aria incapsulate all'interno di coaguli.

Anche il materiale estraneo e i detriti che circolavano nel circuito erano incapsulati nei trombi e aderiti alle superfici della pompa. I trombi anulari alle giunzioni dei connettori dei tubi erano indicativi dell'intervallo ACT ottimale durante il test.