Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

L'ambito della nostra ricerca prevede la creazione di linee di zanzare geneticamente modificate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. L'uso della tecnologia CRISPR-Cas9 per la soppressione della popolazione di zanzare, PgSIT, nonché per la creazione di sistemi di espressione binaria per il controllo temporale spaziale dell'espressione genica.

Abbiamo ottenuto sia linee di knockout che knockin utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Le nostre knockin line includono l'inserimento del transattivatore QF che consente il controllo temporale spaziale dei geni a valle, come i marcatori fluorescenti, GFP, per la marcatura tessuto-specifica e i reporter dell'attività neuronale, G-CaMP6.

La creazione di nuove linee mutanti di zanzara consentirà una comprensione più profonda della funzione genica e delle implicazioni nervose, fisiologiche e comportamentali. Ciò potrebbe portare allo sviluppo di nuovi modi per prevenire la trasmissione di malattie trasmesse dalle zanzare. Il nostro laboratorio ha sviluppato la tecnologia per la soppressione della popolazione di zanzare che si basa sulla tecnologia CRISPR-Cas9 per eliminare i geni correlati alla fertilità maschile e alla vitalità femminile. Inoltre, abbiamo stabilito più linee di zanzare per lo studio della resistenza sensoriale delle zanzare, in particolare l'olfatto e la vista.

[Intervistatore] Per preparare il costrutto di iniezione per mutanti knockout, diluire la proteina Cas9 alla concentrazione desiderata utilizzando il tampone di diluizione Cas9. Quindi diluire l'aliquota di RNA guida o gRNA sintetizzato in vitro con acqua ultrapura. Premiscelare la proteina Cas9 diluita con ciascun gRNA per formare un complesso ribonucleoproteico. Quindi combinare le molteplici soluzioni di complesso ribonucleoproteico premiscelate. Per l'inserimento di cassette geniche mediate dalla riparazione diretta dall'omologia, diluire e mescolare la proteina Cas9 e i gRNA. Diluire il plasmide donatore con acqua ultrapura e combinare tutti i costrutti. Successivamente, utilizzare un filamento di quarzo per preparare gli aghi per microiniezione. Utilizzando il seguente programma. Tirare gli aghi con un estrattore per micropipette laser. Dopo aver installato un aspiratore manuale, inumidire le carte da filtro a cerchio bianco e posizionarle sulla parete interna o sopra il cotone umido all'interno del collettore. Metti da cinque a 10 zanzare femmine che sono state nutrite con sangue da cinque a 10 giorni fa nel raccoglitore. Quindi posizionare il raccoglitore al buio per 45 minuti. Successivamente, rimuovi le zanzare dal collettore. Dopo l'incubazione, rimuovere la carta da filtro per raccogliere gli embrioni. Seleziona gli embrioni allo stadio pre-blastoderma di colore grigio chiaro dalla carta da raccolta. Trasferisci gli embrioni selezionati con un pennello bagnato su del nastro biadesivo posizionato sopra un vetrino coprioggetto. Allinea gli embrioni in parallelo, assicurandoti che siano fianco a fianco con tutte le estremità posteriori rivolte in avanti mentre i loro bordi rimangono bagnati. Durante l'allineamento, aggiungere l'olio alocarbonico 700 sugli embrioni per evitare l'essiccazione. Sul microiniettore, impostare una pressione di compensazione di 300 ettopascal e una pressione di iniezione di 500 ettopascal. Utilizzando un microcaricatore, caricare tre microlitri del costrutto di iniezione in un ago. Posizionare il vetrino coprioggetti con gli embrioni allineati su un vetrino da microscopio e posizionarlo sotto il microscopio per l'iniezione. Quindi, fissare un ago nel portaago con un micromanipolatore con un angolo di 10 gradi verso l'estremità posteriore degli embrioni. Aprire delicatamente l'ago toccando leggermente la punta sul bordo del vetrino coprioggetti. Quindi iniettare l'embrione con il costrutto plasmidico. Dopo aver iniettato le zanzare Aedes agyptie con il costrutto di iniezione, utilizzare salviette usa e getta prive di lanugine per rimuovere l'olio che circonda gli embrioni. Aggiungere acqua deionizzata per sciacquare gli embrioni. Trasferisci gli embrioni sciacquati su una carta da filtro bagnata e posiziona la carta da filtro su un fazzoletto umido all'interno di una tazza da nove once di Karat. Quindi posiziona del cotone bagnato sul fondo della tazza per mantenere l'umidità. Dopo aver mantenuto gli embrioni umidi per tre o quattro giorni, trasferisci la carta da filtro con gli embrioni in circa tre litri di acqua deionizzata in una padella Sterilite da sei quarti per la schiusa. Una volta che le larve G zero si schiudono, aggiungi il cibo per pesci mescolato con acqua nella padella. Screening delle larve G zero per il marcatore fluorescente al terzo e quarto stadio larvale. Separare le larve in base al loro stato di fluorescenza. Conservare le larve fluorescenti positive e fluorescenti negative in vaschette separate. Separa le zanzare iniettate in base al sesso quando si impupano e identifica i maschi in base alle loro dimensioni più piccole, al lobo genitale più prominente e appuntito e alle pale più larghe. Identifica le femmine in base alle loro dimensioni maggiori, al lobo genitale meno pronunciato e alle pale più strette. Dopo aver raggruppato zanzare fluorescenti positive o fluorescenti negative di ciascun sesso, incrociare ogni pozza con zanzare del sesso opposto del ceppo selvatico Liverpool A. agyptie in un rapporto da tre a cinque individui di tipo selvatico per ogni individuo sottoposto a screening fluorescente, consentendo loro di accoppiarsi per quattro giorni. Dopo tre o quattro giorni, esaminare le larve G1 per il marcatore fluorescente al terzo o quarto stadio larvale.