28 febbraio 2025
I meccanismi della morte improvvisa e inaspettata nell'epilessia (SUDEP) sono poco compresi e difficili da tradurre dai modelli attuali. I conigli transgenici possono offrire informazioni su questi meccanismi. Descriviamo un metodo per registrazioni elettroencefalografiche ed elettrocardiografiche continue a lungo termine in kit di coniglio transgenico per valutare eventi gravi che possono portare alla morte.
[Istruttore] Per iniziare, posizionare il kit anestetizzato supino su un termoforo a infrarossi controllato tramite un termometro rettale. Posiziona il naso e la bocca in una maschera facciale stampata in 3D personalizzata collegata tramite un connettore girevole a un circuito Jackson-Reese non rebreathing con una sacca da 0,5 litri. Monitora la profondità dell'anestesia utilizzando un pulsossimetro sull'orecchio o sulla zampa. Posiziona gli asciugamani chirurgici adesivi su entrambi i lati del kit e coprilo con un grande telo chirurgico. Praticare un foro di dimensioni adeguate nel drappeggio per esporre l'addome e il torace. Aprire l'impianto sul campo chirurgico e posizionare le suture di ancoraggio non assorbibili in ciascuno dei fori di ancoraggio dell'impianto, lasciando una coda di cinque o sei centimetri su ciascuna sutura. Posizionare l'impianto in una ciotola di soluzione fisiologica sterile calda fino al momento dell'inserimento. Con l'aiuto di un bisturi, praticare un'incisione di tre centimetri attraverso la pelle lungo la linea alba. E incidere con cura attraverso il muscolo per aprire la cavità peritoneale. Quindi posizionare l'impianto nella porzione cranica della cavità addominale e posizionarlo a sinistra dell'incisione. Utilizzare un trocar per incanalare l'elettrocardiogramma positivo, o ECG, e il filo EEG fuori dalla cavità peritoneale e dalla pelle a circa tre o quattro centimetri a sinistra dell'incisione. Scavare il tunnel del filo ECG negativo due centimetri a destra dell'incisione, consentendo all'impianto di sedersi comodamente all'interno della cavità. Ora, fissare l'impianto con suture di ancoraggio alla parete ventrale della cavità peritoneale, assicurandosi che l'intestino non rimanga intrappolato. E chiudere la parete addominale con una sutura riassorbibile in uno schema interrotto. Quindi chiudere l'incisione cutanea con una sutura non assorbibile in uno schema interrotto. Tunnel L'ECG negativo conduce per via sottocutanea alla parte superiore destra del torace a livello della prima costola. Sezionare senza mezzi termini una tasca sottocutanea per avvolgere liberamente circa 10 centimetri di filo. Tagliare il filo in eccesso e creare un anello dopo aver legato l'estremità esposta al filo isolato con una sutura non assorbibile. Fissare l'anello al muscolo con due punti di sutura non assorbibili. Quindi il tunnel dell'elettrocatetere ECG positivo alla costola inferiore sinistra e ripetere i passaggi dimostrati per fissarlo al muscolo e chiudere l'incisione. Avvolgere i fili EEG esposti con un foglio di alluminio sterile. Lascia che un assistente non sterile rimuova il telo sterile e la cravatta per le gambe. Ruotare il kit in posizione prona, assicurandosi che la maschera facciale rimanga saldamente in posizione ruotando il connettore girevole tra la maschera facciale e il circuito. Regolare il pulsossimetro e il monitor Doppler secondo necessità per mantenere un monitoraggio anestetico continuo. Quindi posizionare una sonda Doppler sul cuore. Posiziona un asciugamano adesivo sterile sotto il lato sinistro, mentre l'assistente tiene il pacchetto di fogli di alluminio contenente i fili. Rimuovere delicatamente i fili dalla confezione di alluminio e posizionarli sul campo sterile, quindi completare il processo di drappeggio con l'asciugamano sterile. Fai un'incisione di tre centimetri lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio. Utilizzare un trocar per incanalare sottocutaneamente le derivazioni EEG dal lato sinistro al cranio. Quindi pulire e raschiare il periostio dalle ossa parietali esposte usando un bisturi. Inserire un trapano portatile in un coperchio sterile per ultrasuoni e guidare una fresa da un millimetro nel trapano. Successivamente, praticare dei fori bilaterali nelle ossa parietali, circa 0,5 centimetri anteriormente alla lambda e 0,5 centimetri lateralmente alla sutura sagittale. Usa una pinza fine per posizionare una vite nel foro della fresa. Quindi utilizzare un cacciavite per inserire la vite a circa metà nel cranio. Ora, seziona senza mezzi termini una tasca sottocutanea lungo la parte posteriore del collo per avvolgere liberamente circa 10 centimetri di filo. Tagliare il filo in eccesso e spelare l'isolamento dalla punta, allungando il filo. Per creare un anello all'estremità del filo esposto, fare un nodo lasciando un piccolo anello. Posiziona l'anello sopra la vite e stringi la vite al cranio, assicurandoti che il filo entri in contatto con la vite. Posizionare il cavo di terra a sinistra e il cavo di registrazione a destra. Ora, fissa le viti e i fili al cranio usando l'acrilico dentale. Infine, iniettare la bupivacaina per via sottocutanea in ogni sito di incisione per alleviare il dolore. E copri ogni incisione con una piccola quantità di colla per la pelle. Una volta che tutti i cavi sono in posizione, valutare i segnali di telemetria utilizzando il software di analisi per verificare la fedeltà del segnale. Aspettati che i segnali EEG appaiano a bassa ampiezza mentre il kit è sedato. La chirurgia implantare è stata eseguita con successo su 15 kit di coniglio, di cui 12 sono sopravvissuti fino al punto finale sperimentale. Le registrazioni telemetriche subito dopo la restituzione dei kit alle gabbie domestiche hanno mostrato segnali EEG di bassa ampiezza, che sono migliorati man mano che i kit si riprendevano dall'anestesia. La morfologia del segnale ECG è leggermente cambiata nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico a causa delle cicatrici e della stabilizzazione del filo. Ma nel complesso, la qualità del segnale è rimasta robusta nel tempo. Il sistema di telemetria impiantato ha consentito la registrazione di molteplici biopotenziali, tra cui elettroencefalografia, temperatura, accelerazione, elettrocardiografia e qualità del segnale.
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Questo studio esplora i meccanismi della morte improvvisa e inattesa nell'epilessia (SUDEP) utilizzando coniglietti transgenici. Viene descritto un metodo per registrazioni a lungo termine ed elettroencefalografiche (EEG) ed elettrocardiografiche (ECG) continue al fine di valutare eventi gravi che potrebbero portare alla morte.
La telemetria EEG ed ECG simultanea in coniglietti transgenici neonati consente un monitoraggio ad alta fedeltà e longitudinale dell'elettrofisiologia neurale e cardiaca, rilevante per i meccanismi della SUDEP. Questo approccio colma un'importante lacuna nella modellizzazione preclinica, catturando aritmie e crisi epilettiche pertinenti alla patologia in un sistema fisiologicamente più simile all'uomo rispetto ai modelli rodentici. Il metodo permette di ottenere un'elevata affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico nelle canalopatie coinvolte nell'epilessia e nel malfunzionamento cardiaco.
Questo modello di coniglio dotato di telemetria costituisce un ponte tra la fase iniziale della scoperta e la validazione preclinica nella ricerca sull'epilessia e sull'aritmia cardiaca, supportando l'identificazione di composti promettenti e studi meccanicistici.