Name: Purificazione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca2+-ATPasi dal muscolo del coniglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara la purificazione della Ca²⁺-ATPasi del reticolo sarco-endoplasmatico dal muscolo di Oryctolagus cuniculus utilizzando trealosio. Questo metodo garantisce elevata purezza e attività catalitica per studi strutturali.

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Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida internazionali e locali (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) per la gestione degli animali nei laboratori sperimentali 51,67,68. Il tessuto muscolare è stato ottenuto da Oryctolagus cuniculus wild-type da un'unità locale di manipolazione degli animali (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Un veterinario esperto nella gestione degli animali da laboratorio ha eseguito la dissezione muscolare iniziale e il trattamento. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Isolamento del reticolo sarcoplasmatico dal muscolo di coniglio a contrazione rapida (Timing, 7 - 9 h)
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a Champeil et al.69.
<ol>
	<li>Ottenere tessuto muscolare a contrazione rapida (~70 g da entrambe le zampe posteriori per animale) da Oryctolagus cuniculus wild-type. NOTA: È richiesta una preventiva identificazione visiva dei muscoli da sezionare70,71.</li>
	<li>Macerare il muscolo a contrazione rapida in un frullatore sospendendolo in tre volumi da 100 mM di KCl, con 1 min in acceso e 1 min in riposo ghiacciato, ripetere tre volte72.</li>
	<li>Rimuovere i detriti di tessuto mediante centrifugazione (1500 × g) a 4 °C per 5 min; Se necessario, viene eseguita una seconda centrifugazione (4200 × g).</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e omogeneizzarlo utilizzando un trituratore per tessuti (10 colpi a bassa velocità, cioè 500-1.500 giri/min)72,73. Centrifugare l'omogeneizzato (10.000 × g) a 4 °C per 15 minuti. NOTA: Prestare attenzione durante l'omogeneizzazione, poiché l'uso di una velocità relativamente elevata può causare danni al sistema e all'operatore.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante (contenente il reticolo sarcoplasmatico) (33.000 × g) a 4 °C per 120 min.</li>
	<li>Sospendere i pellet in 40 mL di 0,5 M di saccarosio e centrifugare (12.000 × g) a 4 °C per 15 min. Diluire il surnatante (0,6 M di KCl e 0,15 M di saccarosio) e centrifugare la sospensione (34.000 × g) a 4 °C per 165 min.</li>
	<li>Sospendere il pellet contenente i fogli delle vescicole del reticolo sarcoplasmatico (SRV) in 0,3 M di saccarosio, 0,1 M di KCl e 5 mM di Tris-HCl, pH 7,0. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Lowry74 e l'albumina sierica umana come standard proteico.</li>
	<li>Aliquotare gli SRV (30-32 mg/mL) in volume di 1 mL. Conservare i campioni di SRV a -72 °C per un'ulteriore elaborazione. NOTA: La resa proteica è di 100-110 mg di SRV per animale.</li>
</ol>
2. Purificazione SERCA (Temporizzazione, 18 - 20 h)
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>Diluire la sospensione di SRV a 2 mg di proteine/mL utilizzando 75 mM ghiacciati di Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M di KCl, 6 mM di EDTA, 1 mM di EGTA e 0,1% (p/v) desossicolato (DOC). Incubare la sospensione di SRV su ghiaccio per 10 minuti e agitare delicatamente. Centrifugare la sospensione SRV (100.000 × g) a 4 °C per 60 min. NOTA: DOC dovrebbe essere aggiunto goccia a goccia.</li>
	<li>Sospendi i pellet in &lt;3 mL di 25 mM di Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M di KCl, glicerolo al 45% (v/v) e 2 mM EDTA. Omogeneizzare la sospensione e regolare fino a un volume finale di 10 mL. Determinare la concentrazione proteica e quindi regolarla a 6,5 mg/mL. Aggiungere azolectina a 5 mg/mL e 0,85 (p/p) Zwittergent 3-14. NOTA: Azolectin e Zwittergent 3-14 devono essere aggiunti goccia a goccia.</li>
	<li>Omogeneizzare la sospensione e centrifugare (100.000 × g) a 4 °C per 60 min. Raccogliere il surnatante e diluire 1:2 con 2 mM di EGTA (pH 7,2).</li>
	<li>Versare delicatamente la sospensione su un gradiente di concentrazione discontinuo di trealosio (45, 40, 35 e 30% p/v) in 10 mM di Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM di EDTA, 0,1% desossicolato e 1 mg/mL di azolectina. Centrifugare (100.000 × g) a 4 °C per 14 h. Raccogliere il pellet trasparente, leggermente giallastro, formatosi sul fondo dei tubi. NOTA: Sia la formazione del gradiente di trealosio che l'aggiunta della sospensione del campione devono essere eseguite utilizzando tecniche appropriate. Si consiglia la centrifugazione notturna.</li>
	<li>Sospendi delicatamente il pellet in un piccolo volume (&lt;1,5 mL) di 25 mM di Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 di M KCl, glicerolo al 45% e 2 mM di EDTA. Determinare la concentrazione proteica. Regolare la concentrazione di proteine mediante diluizione a 2 mg/mL. Prelevare aliquote (~50 μL) della sospensione e conservare il SERCA purificato a -72 °C fino al suo utilizzo.</li>
	<li>Eseguire la SDS-PAGE del SERCA72 purificato e dei campioni proteici prelevati in diverse fasi di purificazione. Colorare il gel con Coomassie Blue72. NOTA: L'uso di trealosio 0,6 M al posto del glicerolo nel tampone di sospensione aumenta la stabilità dell'enzima durante i cicli di conservazione e congelamento-scongelamento28,29.</li>
</ol>
3. Determinazione dell'attività dell'ATPasi (Timing, 1 - 2 h)
<ol>
	<li>Saggio accoppiato a un enzima: ATPasi-piruvato chinasi-lattato deidrogenasi<ol>
		<li>Preparare la miscela di reazione (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpiruvato, 250 μM NADH. Includere concentrazioni variabili di ATP (da 0,001 a 0,25 mM).</li>
		<li>Omogeneizzare accuratamente il saggio di reazione mediante vortex. Incubare il saggio di reazione a 37 °C per 10 minuti. Aggiungere 0,9 U L-lattato deidrogenasi (LDH) e 1,5 U piruvato chinasi (PK).</li>
		<li>Avviare la reazione dell'ATPasi con l'aggiunta di 10 μg di SERCA.</li>
		<li>Determinare la formazione del NADH. Seguire la variazione dell'intensità dell'assorbanza ogni secondo per 600 s a una lunghezza d'onda (λ) di 340 nm nel tempo utilizzando uno spettrofotometro con un portacella termostatato. NOTA: L'intervallo di tempo per la misurazione dell'assorbanza può variare, ma cercare di registrare il maggior numero possibile di punti dati per tracciare la linea retta iniziale della reazione ATPasi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinare il tasso di idrolisi dell'ATP NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a Rivera-Morán et al.46.<ol>
		<li>Calcolare il valore di pendenza (Δabs/min) della porzione lineare in ogni curva formata. Utilizzare il coefficiente di estinzione molare (ε) del NADH (λ = 6.220 M−1·cm−1) per determinare l'attività dell'ATPasi (μmoli di ATP idrolizzato/min.mg prot.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinare i parametri cinetici K, m e Vmax
	<ol>
		<li>Traccia i dati di velocità rispetto alla concentrazione di ATP utilizzando il software di analisi dei dati e la creazione di grafici.</li>
		<li>Adattare i dati mediante regressione non lineare all'equazione di Michaelis-Menten (Eq. 1)46: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> dove v è la velocità, Vmax è la velocità massima, [S] è la concentrazione di ATP e Km è la costante di Michaelis-Menten.</li>
		<li>Determinare K, m e Vmax per iterazione. NOTA: L'inclusione di DOC può aumentare la risposta al tasso di ATPasi; si consiglia di testare diverse concentrazioni di DOC per trovare l'ottimale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Saggio di marcatura di SERCA con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (tempistiche, 30 - 45 minuti, solo per marcatura FITC)
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a 54,75,76.
<ol>
	<li>Sospendere SERCA (20 μg) in 50 μL (volume finale) di tampone di marcatura (100 mM di KCl, 5 mM di MgCl2 e 30 mM di Tris-HCl, pH 8,9) contenente 1 mM di FITC. Mescolare a vortice.</li>
	<li>Incubare i campioni in momenti diversi (15 min, 10 min, 7 min, 5 min e 2 min) al buio e a temperatura ambiente.</li>
	<li>Arrestare la reazione di marcatura aggiungendo 1 volume di tampone di arresto ghiacciato (480 mM di saccarosio e 48 mM di MOPS, pH 7,0), contenente ATP (5 mM). Incubare su ghiaccio per 5 minuti al buio.</li>
	<li>Sottoporre il SERCA con etichetta FITC a SDS-PAGE72. Esporre i gel trasparenti alla luce UV (λ = 302 nm). Documento fotografico del risultato.</li>
	<li>Colorare il gel con il blu Coomassie. Documento fotografico del risultato. NOTA: L'esecuzione della marcatura FITC in una stanza buia può migliorare la qualità del segnale di fluorescenza.</li>
</ol>
5. Spettri di dicroismo circolare (CD) (Temporizzazione, 30 min)
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a11,77.
<ol>
	<li>Sospendere SERCA (3 μM) in 400 μL di tampone fosfato 10 mM (pH 7,0) a 25 °C.</li>
	<li>Caricare il campione in una cella di 0,1 cm di lunghezza del percorso. Impostare l'intervallo λ degli spettri UV lontani tra 190 e 260 nm. Impostare la risoluzione interna e la larghezza di banda a 1 nm.</li>
	<li>Registrare il segnale CD a 50 nm/min a 25 °C.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Azolectina da soia</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore UV da banco</td><td>L'impostazione Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>a doppia intensità è ideale per la documentazione analitica. L'impostazione bassa riduce il photonicking o il photobleaching dei campioni di gel durante l'esecuzione del lavoro preparatorio.</td></tr><tr><td>CaCl2 & toro; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera Coolpix B500</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil maltoside</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,N&prime; Acido -tetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale tetrasodico diidrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecyl-N,N- dimetil-3-ammonio-1-propansulfonato</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Lattato muscolare di coniglio deidrogenasi</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Muscolo di coniglio piruvato chinasi</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>Spectropolarimetro&nbsp;</td><td>Jasco Corp.</td><td>Jasco J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Diidrato</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>Lo spettrofotometro UV-Vis Agilent 8453 utilizza un array di fotodiodi per la misurazione simultanea dell'intero spettro di luce ultravioletta e visibile</td></tr><tr><td>WiseStir HS-30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Ideale per tutte le applicazioni di dispersione e omogeneizzazione, progettato per i trituratori di tessuti.</td></tr></tbody></table>

purificazione del reticolo sarco-endoplasmatico ca2+-atpasi dal muscolo del coniglio

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

SDS-PAGE di SERCA a diversi stadi di purificazione (Figura 1). Il gel colorato di blu di Coomassie mostra l'arricchimento della banda proteica SERCA (peso molecolare apparente &gt;100 kDa) man mano che il protocollo di purificazione progredisce. La banda proteica corrispondente a SERCA mostra una purezza del &gt;90% dopo centrifugazione su un gradiente di concentrazione di trealosio. Grafico del tasso di idrolisi dell'ATP rispetto alla concentrazione di ATP (Fig...

Purificazione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca2+-ATPasi dal muscolo del coniglio

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

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