Purificazione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca²⁺-ATPasi dal muscolo del coniglio

La nostra ricerca si concentra sulla purificazione del SERCA, con un'elevata qualità strutturale e attività catalitica, mentre studia se il trealosio stabilizza il SERCA durante la purificazione, migliorandone la stabilità e la funzionalità. La determinazione della struttura tridimensionale delle ATPasi di tipo P nei loro stati oligomerici. L'uso dell'intelligenza artificiale per la modellazione strutturale delle ATPasi, le simulazioni di dinamica strutturale e il docking molecolare dei ligandi per esplorare le terapie delle malattie e migliorare l'analisi della funzione delle proteine e le nuove tecnologie. Le sfide attuali includono la comprensione dei meccanismi di conversione dell'energia nelle P-ATPasi, il chiarimento di come la struttura quaternaria regola la funzione e l'attività e l'identificazione di inibitori efficaci per l'applicazione terapeutica nelle malattie umane. Confermiamo lo stato esamerico della protone-ATPasi della membrana plasmatica GS e dimostriamo la sua dipendenza dalla dinamica strutturale o viscosità media come descritto dalla teoria di Kramers.

[Narratore] Per iniziare, ottieni muscoli a contrazione rapida da Oryctolagus cuniculus di tipo selvatico. Sospenderlo in tre volumi di cloruro di potassio 100 millimolare per macerazione. Frullare per un minuto, seguito da un minuto di riposo ghiacciato. Centrifugare il campione a 1.500 g a 4 gradi Celsius per 5 minuti per rimuovere i detriti di tessuto. Raccogliere il surnatante in una provetta, quindi omogeneizzarlo con un trituratore di tessuti. Quindi, centrifugare l'omogeneizzato, seguito dal surnatante. Sospendere i pellet in circa 40 millilitri di saccarosio 0,5 molare. Ora, centrifugare la sospensione a 12.000 g a 4 gradi Celsius per 15 minuti. Diluire il surnatante risultante in 0,6 molari di cloruro di potassio e 0,15 molari di saccarosio prima della centrifugazione. Sospendi il pellet contenente fogli di vescicole del reticolo sarcoplasmatico in un tampone contenente 0,3 molari di saccarosio, 0,1 molare di cloruro di potassio e 5 millimolari di Tris-cloridrato a pH 7,0. Aliquotare le vescicole del reticolo sarcoplasmatico in volumi di 1 millilitro. Incubare la sospensione della vescicola del reticolo sarcoplasmatico su ghiaccio per 10 minuti con una leggera agitazione, quindi centrifugare. Sospendere il pellet in meno di 3 millilitri di tampone Tris-cloridrato da 25 millimolari. Dopo aver omogeneizzato la sospensione, regolarla fino a un volume finale di 10 millilitri con tampone Tris-cloridrato. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Lowry. Aggiungere azolectina a 5 milligrammi per millilitro e poi aggiungere 0,85 Zwittergent 3-14. Omogeneizzare nuovamente la sospensione e centrifugare a 100.000 g a 4 gradi Celsius per 60 minuti. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Diluirlo in un rapporto 1 a 2 con EGTA da 2 millimolari a pH 7,2. Versare delicatamente la sospensione su un gradiente discontinuo di concentrazione di trealosio in tampone Tris. Quindi centrifugare come prima e raccogliere il pellet trasparente, leggermente giallo. Sospendi delicatamente il pellet in un piccolo volume di tampone Tris. Misurare la concentrazione proteica, quindi diluirla per regolare la concentrazione proteica a 2 milligrammi per millilitro. Per l'attività dell'ATPasi, preparare 1 millilitro della miscela di reazione. Agitare il saggio di reazione per omogeneizzarlo, quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 0,9 unità di L-lattato deidrogenasi e 1,5 unità di piruvato chinasi. Aggiungere 10 microgrammi di SERCA per avviare la reazione ATPasi. Monitora la variazione dell'assorbanza ogni secondo per 600 secondi a 340 nanometri con uno spettrofotometro dotato di un supporto per cella termostatica per determinare la formazione di NAD. Per il saggio di marcatura di SERCA con isotiocianato di fluoresceina, o FITC, sospendere prima 20 microgrammi di SERCA in 50 microlitri di tampone di marcatura. Vortice per mescolare bene. Quindi incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 15, 10, 7, 5 e 2 minuti. Per fermare la reazione di etichettatura, aggiungere un volume uguale di tampone di arresto ghiacciato. Incubare su ghiaccio al buio per 5 minuti. Sottoporre il SERCA con etichetta FITC a SDS-PAGE. Esporre i gel trasparenti alla luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 302 nanometri e fotodocumentare il risultato. Infine, colorare il gel con il blu Coomassie. Fotodocumenta il risultato. Per l'analisi degli spettri del dicroismo circolare, sospendere prima SERCA in 400 microlitri di tampone fosfato da 10 millimolari a pH 7,0 a 25 gradi Celsius. Caricare il campione in una cella con una lunghezza del percorso di 0,1 centimetri. Ora, imposta l'intervallo degli spettri ultravioletti lontani tra 190 e 260 nanometri e la risoluzione interna e la larghezza di banda a 1 nanometro. Registra il segnale di dicroismo circolare a una velocità di 50 nanometri al minuto a 25 gradi Celsius. Il gel SDS-PAGE colorato di blu di Coomassie ha dimostrato l'arricchimento della banda proteica SERCA con il progredire della purificazione. La fase finale di purificazione SERCA mediante ultracentrifugazione su un gradiente di concentrazione di trealosio ha portato a una purezza superiore al 90%. Le vescicole del reticolo sarcoplasmatico contenevano un'elevata quantità di SERCA, con circa il 73% delle proteine totali nelle vescicole corrispondenti a questa P-ATPasi. È stato osservato un pattern cinetico di Michaelis-Menten per il SERCA purificato nella curva del tasso di idrolisi dell'ATP rispetto alla concentrazione di ATP, confermando la sua funzionalità enzimatica. Il grafico di Lineweaver-Burk ha rivelato una costante di Michaelis di circa 10 micromoli per l'ATP, coerente con i valori precedentemente riportati. La marcatura FITC di SERCA ha indicato un sito di legame nucleotidico intatto. La banda SERCA colorata di blu Coomassie corrispondeva esattamente alla banda etichettata FITC. La spettroscopia di dicroismo circolare ha confermato l'elevata qualità strutturale della SERCA purificata, con il suo spettro che indica elementi di struttura secondaria ben definiti.