Estrazione e pulizia dei tessuti Preparazione di campioni di cervello e midollo spinale di topo

La nostra ricerca si concentra su come il sistema nervoso centrale media le funzioni cognitive e interagisce con il sistema immunitario. Il nostro obiettivo è quello di migliorare i metodi per l'esame del cervello e del midollo spinale, affrontando le domande fondamentali su queste interazioni. Questi metodi mantengono intatto l'intero cervello e il midollo spinale, il che ci aiuta a mappare la cellula in modo più accurato utilizzando la pulizia dei tessuti. Inoltre, rende il processo più rapido e accurato, riducendo i tempi e gli errori rispetto ai metodi tradizionali di sezionamento e imaging.

Abbiamo mappato il cervello e le regioni del midollo spinale collegate ai polmoni cedendo . La nostra ricerca si concentrerà sull'esplorazione della comunicazione neuroimmunitaria tra il cervello, il midollo spinale e i polmoni. E come questa interazione influenza le risposte immunitarie.

[Istruttore] Per iniziare, fissa gli arti del mouse all'ampia tavola acrilica usando morsetti in acciaio. Con l'aiuto delle forbici, tagliare la pelle tra i due femori e continuare a tagliare verso l'alto fino a raggiungere il diaframma. Apri entrambi i lati del torace attraverso il diaframma, usando forbici e pinze dritte per esporre il cuore. Inserire un ago per infusione da 0,7 millimetri collegato a un tubo di perfusione nel ventricolo sinistro e praticare un'incisione di uno o due millimetri nell'appendice atriale destra. Dopo la perfusione, separare la pelle sul dorso e sulla testa del topo utilizzando le forbici oftalmiche. Recidere la colonna vertebrale nel punto in cui la linea che collega i bordi posteriori superiori di entrambi gli arti si interseca con la colonna vertebrale. Rimuovere il tessuto muscolare e adiposo dal collo e dalla parte posteriore del topo per esporre la colonna vertebrale e il cranio. Con le forbici venose, tagliare lungo lo spazio della linea mediana tra i lati sinistro e destro della colonna vertebrale e del midollo spinale dall'estremità inferiore del canale vertebrale. Quindi rimuovere la parte superiore e i lati bilaterali della colonna vertebrale recisa per esporre il midollo spinale. Ripeti i passaggi fino a raggiungere la connessione cerebrale. Posizionare la punta di una lama delle forbici venose tra il forame magno e il cervello. Far scorrere e tagliare lungo la sutura sagittale media per aprire il cranio. Usa il forcipe per rimuovere il cranio ed esporre il cervello. Ora, usando una pinza e delle forbici venose, rimuovi il tessuto del midollo spinale del cervello del topo dall'estremità cranica. Utilizzare una pinza da dissezione per rimuovere la membrana del midollo spinale sotto lo stereomicroscopio. Quindi, con le suture, fissare il campione di midollo spinale cerebrale alla piastra di fissaggio. Aggiungere almeno 20 volte il volume del campione di paraformaldeide al 4%. Dopo il fissaggio, eliminare la paraformaldeide e lavare il campione tre volte con PBS. Per iniziare, fissare il midollo spinale del cervello di topo estratto in paraformaldeide. Per la soluzione di rimozione dei lipidi, mescolare le soluzioni A e B con un rapporto di massa di nove a uno. Aggiungere 50 millilitri della soluzione per la rimozione dei lipidi in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e posizionare il tessuto fissato al suo interno. Dopo l'incubazione nella soluzione C, cambiare la soluzione e posizionare la piastra di coltura con il campione completamente immerso nella soluzione C su una scatola luminosa con una linea di scala. Per preparare la soluzione in gel, aggiungere 147 grammi di soluzione C e tre grammi di agarosio a un flacone di vetro da 200 millilitri. Mescolare bene i componenti con un'asta per mescolare, quindi cuocere nel microonde fino a quando l'agarosio non si scioglie. Trasferire la soluzione di gel in un forno da laboratorio impostato a 37 gradi Celsius. Versare uno strato profondo due millimetri di soluzione di gel temperato a 37 gradi Celsius nello stampo e raffreddarlo in frigorifero a quattro gradi Celsius per 30 minuti fino a quando non sarà semisolido. Posizionare il campione abbinato all'indice di rifrazione nello stampo e aggiungere la soluzione di gel fino al livello o leggermente al di sotto della parte superiore del campione. Rimettete lo stampo in frigorifero a quattro gradi Celsius per due ore. Coprire con un vetrino coprioggetto e riporre nuovamente in frigorifero. Rimuovere il vetrino coprioggetti con una pinzetta ed estrarre il campione incorporato. Aggiungere 30 millilitri di soluzione di imaging a una provetta da 50 millilitri e immergere il campione nella soluzione. Applicare l'adesivo 502 per fissare saldamente il campione sul supporto del campione, prima di fissare il supporto sul dispositivo di imaging. Eseguire il software di scansione e selezionare il livello di ingrandimento 4X nella sezione di ingrandimento. Fare clic sul pulsante di calibrazione per attivare la modalità di calibrazione. Fare clic sul pulsante di anteprima per accedere alla modalità di anteprima. Quindi fare clic sul pulsante di movimento della direzione Z per spostare lentamente il campione verso l'alto dal fondo della camera del campione fino a quando il foglio luminoso generato non passa attraverso il campione. Selezionare il canale laser appropriato e l'opzione della modalità di illuminazione. Selezionare la direzione del percorso di scansione per il campione. Fare clic sul pulsante di scansione automatica per iniziare a catturare le immagini del campione. Il protocollo ha preservato con successo l'intero cervello e il midollo spinale del topo, mantenendo intatti i segnali fluorescenti per un imaging chiaro. L'imaging fluorescente del campione del midollo spinale cerebrale ha visualizzato chiaramente le strutture neurali dettagliate. Le immagini con ingrandimento più elevato hanno fornito una migliore visualizzazione delle singole cellule marcate in fluorescenza.