Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali

Il nostro obiettivo è identificare sistematicamente e indirizzare terapeuticamente gli hub di rete critici con particolare attenzione agli RNA non codificanti nel cancro. L'attuale sfida sperimentale del nostro approccio risiede nella capacità combinatoria necessaria per generare e selezionare un gran numero di geni in parallelo. Il nostro obiettivo è quello di aprire la strada all'identificazione di nuovi bersagli di RNA combinatoriali non codificanti o strutture farmacologiche per eludere la resistenza e la fuga terapeutica.

In futuro, tradurremo questo strumento di prova di concetto in sforzi di screening di librerie combinatorie su larga scala, potenzialmente in combinazione con proteine leganti l'RNA, sia in vitro che in vivo. Per iniziare, contare le cellule HEK Lenti-X 293T utilizzando il colorante blu di tripano in un emocitometro. Piastra 4 volte 10 alla potenza di 6 cellule Lenti-X 293T HEK per piastra da 10 centimetri e incuba per raggiungere circa l'80% di confluenza il giorno successivo.

Da questo passaggio in poi, lavora in un laboratorio di classe 2. Mescolare 500 microlitri di un mezzo di trasfezione adatto con il vettore di trasferimento, il plasmide dell'involucro e il vettore pPAX2. Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.

In una provetta separata, mescolare 500 microlitri di terreno sierico ridotto con 36 microlitri di reagente PEI a una concentrazione di 1 milligrammo per millilitro. Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Unire le due miscele e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Ora con attenzione, goccia a goccia, aggiungere la miscela al terreno cellulare contenente sei millilitri e incubare per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Dopo 12-15 ore, gettare il terreno in un flacone di scarto autoclavabile utilizzando una pipetta sierologica. Sciacquare i materiali di consumo, comprese le pipette sierologiche e i puntali delle pipette, con una soluzione disinfettante prima di smaltirli nei rifiuti dell'autoclave.

Aggiungere cinque millilitri di DMEM fresco alle cellule trasfettate utilizzando una nuova pipetta. Per raccogliere i lentivirus, trasferire il surnatante utilizzando una pipetta sierologica in una provetta canonica da 50 millilitri, 48 ore dopo la trasfezione. Quindi aggiungere 5 millilitri di terreno fresco alle cellule e incubarle per altre 24 ore.

Conservare il tubo in frigorifero. Dopo l'incubazione, ripetere la raccolta dei lentivirus e raggrupparla con il campione raccolto in precedenza. Dopo il terzo raccolto, conservare i surnatanti combinati di tutti e tre i raccolti a quattro gradi Celsius fino alla filtrazione e alla centrifugazione.

Centrifugare il surnatante combinato per 5 minuti a 500 G e 4 gradi Celsius in contenitori a tenuta di aerosol e rotori approvati per gli organismi del gruppo di rischio 2, quindi filtrare il surnatante attraverso filtri per siringa sterili per colture cellulari da 0,2 micrometri. Concentrare il surnatante filtrato a 1000 g e quattro gradi Celsius utilizzando un'unità di filtro centrifugo con un taglio del peso molecolare di 100 kilodalton a circa 500 microlitri. Conservare aliquote di virus da 50 a 100 microlitri a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Piastra le cellule 501-mel in una piastra a sei pozzetti a 2 volte 10 alla potenza di 5 cellule per pozzetto con un volume di coltura finale di 2 millilitri un giorno prima della trasduzione. Sostituire il terreno di coltura con 2 millilitri di DMEM preriscaldato integrato con polibrene alla concentrazione finale di 6 microgrammi per millilitro. Lavorare in un laboratorio di classe 2 da questo passaggio in poi.

Aggiungere 50 microlitri di lentivirus SPD e SAD preparati contemporaneamente alle cellule goccia a goccia. Agitare delicatamente la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. 16 ore dopo la trasduzione, gettare il terreno in un flacone autoclavabile utilizzando una pipetta sierologica.

Aggiungere 2 millilitri di terreno fresco contenente 10 microgrammi per millilitro di blasticidina e 2 microgrammi per millilitro di puromicina. Ripetere la fase di sostituzione del terreno dopo due giorni e maneggiare le cellule trasdotte in condizioni S1 dopo sette giorni dalla trasduzione. Seminare 0,1 volte 10 alla potenza di 5 cellule contenenti SadCas9 KRAB e Sp-dCas9-KRAB trasfettati stabili sette giorni dopo la trasduzione in una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di DMEM preriscaldato.

Il giorno della trasduzione, sostituire il terreno con 100 microlitri di DMEM preriscaldato integrato con polibrene a 6 microgrammi per millilitro. Aggiungere il volume appropriato di lentivirus alle cellule e incubare la piastra. Dopo 16 ore, sostituire il terreno con un terreno fresco contenente zeoina, blasticidina e puromicina.

Eseguire il rilevamento della luminescenza cinque giorni dopo la trasduzione utilizzando un test di vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore. L'analisi del sangue Western ha confermato il successo dell'espressione delle proteine di fusione SpdCas9 e SadCas9 nelle cellule del trasduttore 501-mel. L'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi ha mostrato un efficace knockdown dei singoli RNA lunghi non codificanti RP11 e XLOC utilizzando specifici RNA guida, ma solo la coppia XLOC-sa e RP11-sp ha represso con successo entrambi i bersagli contemporaneamente.

La doppia repressione di RP11 e XLOC utilizzando la coppia GRNA XLOC-sa e RP11-sp ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule 501-mel al 59% rispetto al controllo.