Name: Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri una strategia CRISPRi duale per il targeting di interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali. Questo metodo combinatorio identifica nuove interazioni lncRNA per terapie oncologiche.

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Sebbene meno del 3% del genoma umano codifichi proteine, circa l'80% del genoma è trascritto 1,2. Tra le unità trascrizionali non codificanti, decine di migliaia sono classificate come RNA lunghi non codificanti (lncRNA) superiori a 200 nucleotidi e si stima che il numero totale di lncRNA umani superi i 100.000 3,4. A differenza dei geni codificanti, gli lncRNA sono meno conservati tra le specie. Dato che gli esseri umani condividono il 99% del loro genoma con primati come gli scimpanzé, si ipotizza che gli lncRNA abbiano un'influenza molto maggiore sull'evoluzione fenotipica 5,6. Questi risultati indicano importanti funzioni cellulari degli lncRNA. Sebbene la regolazione degli lncRNA e le loro interazioni con le proteine leganti l'RNA e altri RNA rimangano non completamente comprese, e molti lncRNA debbano ancora essere completamente annotati, è chiaro che gli lncRNA mostrano modelli di espressione specifici per cellule e tessuti in salute e malattia, come il cancro 7,8,9,10. Sono implicati in diverse funzioni, tra cui la regolazione della trascrizione genica, il coinvolgimento nelle interazioni della cromatina11, l'elaborazione dell'RNA12, la stabilizzazione dell'RNA13 e la regolazione della traduzione14.
Nel cancro, lncRNA altamente diversi e specifici per tipo di cellula influenzano lo sviluppo e le metastasi tumorali regolando l'espressione genica, evidenziando il loro potenziale come preziosi bersagli terapeutici15. Oltre al rilevamento di lncRNA come biomarcatori in campioni tumorali16, il targeting di lncRNA specifici per tumore per interrompere le loro funzioni a valle ha un potenziale significativo sia nelle applicazioni cliniche che nella ricerca di base. Gli approcci basati sull'RNA per chiarire i ruoli degli lncRNA includono oligonucleotidi antisenso (ASO), RNA a forcina corta e piccoli RNA interferenti (siRNA)17,18. Mentre il siRNA è comunemente utilizzato per gli screening di silenziamento genico, il knockdown basato su siRNA è limitato al citoplasma19. Tuttavia, lncRNA opera frequentemente all'interno del nucleo.
In alternativa, l'interferenza CRISPRi (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) può essere utilizzata per inibire gli lncRNA nei tumori umani20. Inoltre, gli screening CRISPRi per l'intero genoma possono essere facilmente programmati e mirano a un'ampia gamma di geni codificanti e non codificanti per esaminarne l'impatto funzionale21,22. In CRISPRi un Cas9 catalitico deficiente (dCas9) è fuso in un dominio repressore trascrizionale, come il dominio23 della scatola associata a Krüppel (KRAB). La repressione genica da parte di dCas9-KRAB è guidata da un RNA guida (gRNA) verso la regione di interesse. CRISPRi controlla i geni a livello di DNA, portando a una maggiore efficienza e ai fenotipi desiderati con perdita di funzione in contrasto con l'interferenza dell'RNA, che è attiva a livello post-trascrizionale24. In risposta alla limitata efficacia di KRAB nel silenziamento del bersaglio, è stata introdotta una fusione di KRAB e MeCP2 con dCas9 come strategia di repressione più efficace25.
Sebbene il silenziamento di un singolo gene possa influenzare la vitalità del cancro, le interazioni letali sintetiche doppie o multiple possono salvare le cellule tumorali dalla morte cellulare26. La letalità sintetica coinvolge due o più geni, ognuno dei quali può compensare la funzione dell'altro. Per superare i problemi con gli screening knockdown di un singolo gene, le doppie strategie CRISPR mirate a coppie di geni codificanti proteine letali offrono un approccio promettente27.
Qui, presentiamo un protocollo per l'uso combinatorio del targeting ortogonale basato su CRISPRi di lncRNA o altre coppie di RNA non codificanti utilizzando Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes dCas9 fusi a KRAB-MeCP2 in cellule di melanoma umano (vedi Figura 1). Il protocollo può essere utilizzato per il knockdown combinato classico di CRISPR o come screening basato su CRISPRi di coppie letali sintetiche nel cancro. L'uso di due diverse specie di dCas9, SpCas9 e SaCas9, nell'approccio CRISPRi consente di mirare in modo indipendente a loci genomici distinti con una reattività crociata minima, migliorando la specificità e la flessibilità e garantendo al contempo un'elevata selettività sul bersaglio. Vengono utilizzati diversi motivi adiacenti protospaziatori (PAM): NGG per SpCas9 e NNGRRT per SaCas9. Il doppio sistema dCas9 affronta sfide come la limitata compatibilità con gli sgRNA, consentendo una modulazione precisa e simultanea e riducendo la competizione del complesso sgRNA-RNP quando si utilizza un singolo tipo di dCas9. Questa innovazione migliora la robustezza e la versatilità dello screening della doppia libreria di sgRNA. In conclusione, forniamo un doppio sistema CRISPRi completamente funzionale in cellule di melanoma come modello di cancro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema del doppio sistema CRISPRi per indirizzare le interazioni letali sintetiche di RNA non codificanti. (A) Procedura di clonaggio del vettore gRNA duale. (B) Le cellule HEK293 sono state trasfettate con il plasmide dell'involucro VSV-G, il plasmide PAX2 di imballaggio e il vettore di trasferimento per produrre lentivirus per la successiva trasduzione in cellule 501-mel. I lentivirus contenenti le informazioni genetiche per SpdCas9-KRAB-MeCP2 (blu) e SadCas9-KRAB-MeCP2 (rosso) sono stati integrati contemporaneamente in cellule 501-mel. Dopo la selezione degli antibiotici, è stata eseguita una seconda trasduzione lentivirale per integrare i doppi gRNA desiderati (verde oliva). (C) Le cellule 501-mel che esprimono le varianti dCas9 interagiscono con i loro corrispondenti gRNA per silenziare l'espressione genica bersaglio, con conseguente morte delle cellule tumorali. Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Filtro ultra centrifugo Amicon, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo anti-Cas9 (S. aureus) (6H4)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) anticorpo monoclonale</td> Tecnologia <td>di segnalazione cellulare</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (molecola intera)... Anticorpo perossidasi prodotto nel</td> sistema di imaging <td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP di</td> coniglio.<td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina S cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare luminescente</td><td>Centrifuga Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifuga Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td></td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato ECL occidentale Clarity, incubatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td>CO2 da 500 mL</tr><tr><td>Modello CB 170</td><td>Legante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibitore completo della proteasi Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>enzima di restrizione Esp3I (BsmB1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Pipetta sierologica</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica Falcon 25 mL</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Pipetta sierologica</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM), glucosio alto, piruvato</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>La linea cellulare di melanoma umano 501-mel</td><td>è stata gentilmente fornita dal laboratorio Aifantis (New York University)</td><td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK cell</td> line <td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell system...</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl E. coli chimicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR 0,5 ml (tappo piatto)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR Master Mix ad alta fedeltà con tampone HF</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, ramificato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Provetta per microcentrifuga 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 5 M Soluzione d'acqua, Senza RNasi</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa PES 33mm 0,2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Piastra 6 Pozzetti, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

doppia strategia di interferenza crispr per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra rna non codificanti nelle cellule tumorali

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

Le cassette di espressione di SadCas9-KRAB-MeCP2 e SpdCas9-KRAB-MeCP2 sono state integrate simultaneamente in cellule 501-mel utilizzando la trasduzione con quantità uguali di lentivirus. Poiché questo protocollo CRISPRi si basa sull'espressione delle varianti dCas9-KRAB-MeCP2, l'analisi Western blot è ideale per confermare la loro presenza a livello proteico. Dopo l'arricchimento di cellule trasfettate positivamente, sono stati raccolti campioni per l'analisi Western blot per confermare la presenza degli ortologhi dCas9-KRAB-MeCP2. Dopo il successo della trasduzione, ci si aspetta una singola banda corrispondente alla proteina di fusione SpdCas9-KRAB-MeCP2 (202 kDa) e alla proteina di fusione SadCas9-KRAB-MeCP2 (170 kDa) ed è stata confermata, come mostrato in Figura 2A, utilizzando anticorpi specifici per i rispettivi ortologhi Cas9. Tuttavia, se il Western blot non è fattibile, la qPCR può essere utilizzata per verificare le proteine di fusione a livello di mRNA.
Una volta generate le cellule 501-mel che esprimono stabilmente i repressori funzionali, la seconda trasduzione lentivirale è stata eseguita utilizzando un vettore a doppio gRNA. In precedenza era stato dimostrato che RP11 e XLOC erano sovraregolati in colture a breve termine di melanoma metastatico e il targeting individuale di CRISPRi ha dimostrato il loro impatto sulla proliferazione e sulla sopravvivenza cellulare28. Pertanto, abbiamo selezionato questa coppia di lncRNA per la valutazione come una combinazione di RNA non codificante letale sintetico proof-of-concept, anticipando un fenotipo di crescita cumulativo e facilmente osservabile nelle cellule modificate.
Per studiare gli effetti del doppio CRISPRi nelle cellule tumorali utilizzando saggi di vitalità, entrambi gli lncRNA mirati devono essere efficacemente repressi. La qPCR è il metodo più adatto per confermare questa repressione misurando i loro livelli di trascrizione. Abbiamo valutato la funzionalità del doppio protocollo CRISPRi sviluppato determinando i livelli di RNA ed esaminando la vitalità cellulare quando si prende di mira la coppia RP11 e XLOC potenzialmente letale. Pertanto, sono stati introdotti diversi gRNA che hanno come bersaglio RP11 e XLOC per ridurre i livelli di RNA bersaglio. La repressione dell'RNA è stata studiata utilizzando gRNA target-specifici per SadCas9-KRAB-MeCP2 o SpdCas9-KRAB-MeCP2, testati singolarmente e in combinazione insieme a un gRNA di controllo mirato a Rosa26 (vedi Figura 2B). Sebbene i gRNA che hanno come bersaglio XLOC o RP11 abbiano soppresso efficacemente i rispettivi bersagli, il knockdown simultaneo di XLOC e RP11 è stato ottenuto solo con la coppia XLOC-sa/RP11-sp.
Poiché sia i livelli di RNA XLOC che RP11 sono stati ridotti con successo nella linea cellulare 501-mel con la coppia di gRNA XLOC-sa/RP11-sp selezionata, è stato eseguito un doppio test di vitalità della repressione dell'lncRNA (vedi Figura 2C). Dopo 5 giorni, la vitalità cellulare era dell'81% e dell'89% del controllo di Rosa26 quando i gRNA bersaglio sono stati utilizzati singolarmente. La combinazione di RP11-sp e XLOC-sa ha portato a un'ulteriore riduzione significativa rispetto al solo RP11-sp, con una vitalità cellulare al 59% del controllo Rosa26.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
Figura 2: Funzionalità del doppio sistema di repressione dell'lncRNA. (A) L'analisi Western blot è stata eseguita per rilevare le varianti dCas9-KRAB-MeCP2 in cellule 501-mel modificate utilizzando anticorpi anti-Cas9. Come controllo sono state utilizzate cellule 501-mel wild-type (WT) senza trasduzione (vedi Figura supplementare 3, Figura supplementare 4, Figura supplementare 5, Figura supplementare 6 per il raw blot). (B) analisi basata sulla qPCR dei livelli di RP11 e XLOC RNA relativi alle cellule di controllo Rosa26 dopo la trasduzione di doppi gRNA in cellule 501-mel modificate. GAPDH è stato usato come gene delle pulizie. I dati sono espressi come media ± SD. (C) Il saggio di vitalità della repressione a doppio lncRNA è stato eseguito dopo l'integrazione di doppi gRNA in cellule 501-mel modificate in tre trasduzioni indipendenti. I valori di luminescenza sono stati normalizzati al controllo Rosa26. I risultati di vitalità sono espressi come media (n = 3) ± SEM. È stato eseguito un t-test non appaiato. L'asterisco (*) indica una differenza significativa a p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Mappa plasmidica. La mappa è stata creata con Benchling (https://benchling.com/). I plasmidi utilizzati nel protocollo sono stati modificati da Addgene #96921 e #110824. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Figura 2 supplementare: Analisi del western blot di Espressione dCas9-KRAB. (A) Espressione di SadCas9-KRAB in cellule 501-mel 6 giorni dopo la trasfezione. (B) La trasduzione sequenziale di SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB in cellule 501-mel ha portato a una riduzione dell'espressione di SadCas9-KRAB 3 settimane dopo la trasfezione. (C) La trasduzione simultanea di SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB in cellule 501-mel ha determinato una riduzione dell'espressione di SadCas9-KRAB 3 settimane dopo la trasfezione. (D) L'espressione di SpdCas9-KRAB può essere osservata dopo la trasduzione simultanea di SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB. LV. Il volume di lentivirus utilizzati in μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Dati grezzi SaCas9-KRAB del Western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 4 supplementare: Dati grezzi Western blot SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 5: Dati grezzi GAPDH_SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 6 supplementare: Dati grezzi GAPDH_SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Sequenze di RNA guida utilizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 2: Sequenze di DNA utilizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: File FASTA di dual-grna-zeo-gfp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: file FASTA di dSpCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: file FASTA di dSaCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

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CRISPR/Cas9 è un sistema robusto per produrre la distruzione di geni ed elementi genetici. Qui descriviamo un protocollo per la creazione efficiente di delezioni genomiche in linee cellulari di mammifero utilizzando CRISPR/Cas9.

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

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I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

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Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.

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La somministrazione diretta di complessi preassemblati di ribonucleoproteina di RNA Cas9/guide è un mezzo veloce ed efficiente per l'editing del genoma nelle cellule ematopoietiche. Qui, utilizziamo questo approccio per eliminare un silenziatore intronico RUNX1 ed esaminare le risposte trascrizionali nelle cellule leucemiche OCI-AML3.

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Grandi schermi genetici negli organismi modello hanno portato all'identificazione di interazioni genetiche negative. Qui descriviamo un flusso di lavoro di integrazione dei dati utilizzando i dati degli schermi genetici negli organismi modello per delineare combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche nel cancro.

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

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Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

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Screening CRISPR a livello di genoma per svelare geni radiosensibili e radioresistenti

Scopri una strategia CRISPRi duale per il targeting di interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali. Questo metodo combinatorio identifica nuove interazioni lncRNA per terapie oncologiche.

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Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali

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