Un metodo efficiente per l'estrazione degli epiteli umani delle tube di Falloppio per l'analisi di singole cellule

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione e la lotta alla chemio-resistenza nei tumori ovarici. Il nostro obiettivo è quello di scoprire i meccanismi e le sottopopolazioni cellulari che guidano la resistenza e nuovi bersagli per sradicare queste popolazioni aggressive.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula facilita la caratterizzazione delle sottopopolazioni nei tumori ovarici eterogenei. Sfruttiamo le cellule epiteliali delle tube di Falloppio non cancerose come cellula di origine normale per le analisi del cancro ovarico.

L'efficiente isolamento delle cellule epiteliali delle tube di Falloppio in una sospensione arricchita di una singola cellula aiuterà a comprendere ulteriormente l'inizio della malattia del carcinoma ovarico sieroso di alto grado. Questa tecnica di digestione meccanica ed enzimatica offre un processo più efficiente per l'estrazione di una sospensione monocellulare arricchita di cellule epiteliali vitali delle tube di Falloppio.

[Narratore] Per iniziare, raccogli le tube di Falloppio umane fresche in una provetta da 15 o 50 millilitri contenente mezzi di dissociazione e posiziona la provetta sul ghiaccio. Trasferire le tube di Falloppio in una capsula di Petri sterile contenente mezzi di dissociazione freschi e posizionare il campione sotto un microscopio da dissezione. Ora, usando una pinza a punta fine e le forbici Vannas-Tubingen, seziona il grasso, il tessuto connettivo e tutti i vasi che circondano i tubi. Quindi, tagliare il piano coronale delle tube di Falloppio con le forbici per formare piccoli cilindri con un diametro da tre a cinque millimetri. Usa una pinza fine=point per stabilizzare il tessuto durante il taglio. Aspirare con cautela il mezzo di dissociazione dal piatto contenente i pezzi di tessuto. Lavare i pezzi di tessuto due volte con due millilitri di 1x PBS freddo e ruotare leggermente la piastra. Dopo aver aspirato il PBS, incubare i pezzi di tessuto per cinque minuti in EDTA freddo da cinque millimolari a temperatura ambiente. Sospendi i frammenti di tessuto in una soluzione salina bilanciata fredda all'1% di tripsina Hanks e incuba a quattro gradi Celsius per 40 minuti. Aspirare la soluzione salina bilanciata di tripsina all'1% e lavare due volte i pezzi di tessuto in un mezzo di dissociazione freddo per inattivare la tripsina. Incubare i frammenti di tessuto in due millilitri di terreno di dissociazione con 0,4 milligrammi di DNasi per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Sotto un microscopio da dissezione, mentre si è ancora in DNasi, tenere un frammento della tuba di Falloppio con una pinza in modo che il lume sia parallelo al fondo della piastra. Usa una pinza per premere ripetutamente sul tessuto per espellere le cellule epiteliali dal lume. Confermare il rilascio di un alone di cellule attorno al tessuto. Trasferire le cellule contenenti terreno in una provetta sterile da 15 millilitri. Lavare due volte la piastra di Petri con il mezzo di dissociazione e unire i lavaggi nella stessa provetta. Scartare i frammenti rimanenti del tubo stromale. Per raccogliere le cellule, centrifugarle a 500 g per cinque minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di dissociazione. Ora, mescola 10 microlitri di sospensione cellulare con un volume uguale di blu di tripano. Pipettare 10 microlitri di miscela in un vetrino di conteggio della camera e inserirlo in un contatore di cellule per determinare la conta cellulare. Risospendere le cellule in nove millilitri di terreno di dissociazione contenente collagenasi di tipo uno e DNasi. Incubare a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti in un agitatore orbitale impostato a 200 giri/min. Per raccogliere le cellule, centrifugare a 500 g per cinque minuti. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di dissociazione per lavare via la collagenasi. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in una provetta da 50 millilitri e centrifugare il filtrato a 500 g per cinque minuti. Se il pellet cellulare appare rosso, preparare un tampone di lisi dei globuli rossi per lisare i globuli rossi. Aspirare il terreno dal pellet, aggiungere cinque millilitri del tampone di lisi dei globuli rossi diluito e incubare il campione su ghiaccio per tre minuti. Per interrompere la lisi dei globuli rossi, aggiungere 45 millilitri di 1x PBS alla provetta. Centrifugare la provetta a 500 g per cinque minuti. Dopo aver raccolto e risospeso le cellule in un millilitro di terreno di dissociazione, mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare con un volume uguale di blu di tripano. Pipettare 10 microlitri di miscela in un vetrino di conteggio della camera e inserirlo nel contacellulare. L'analisi di citometria a flusso ha confermato l'isolamento di una popolazione di cellule epiteliali vitali e arricchite dal tessuto delle tube di Falloppio con una vitalità media dell'82%. Dopo l'estrazione delle cellule immunitarie CD45 positive, le cellule epiteliali positive per EpCAM costituivano in media l'80% del campione, mentre la contaminazione delle cellule stromali CD10 positive era minima al 7,8%. Le cellule epiteliali isolate hanno formato cluster aderenti simili a ciottoli in coltura 2D dopo quattro-sei giorni di placcatura, confermando l'identità epiteliale. L'immunochimica ha rivelato che la maggior parte delle cellule in coltura esprimeva EpCAM e PAX8 con solo poche cellule positive alla vimentina. Le cellule ciliate erano presenti in coltura.