Name: Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri come sviluppare un sistema di cocoltura 3D con membrane nanofibrose di PVA e PCL per l'ingegneria tissutale. Questo metodo supporta l'adesione e la crescita di cellule epiteliali e fibroblasti, migliorando lo studio delle interazioni cellulari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzato di co-coltura 3D a due strati per cellule epiteliali e fibroblasti

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina/EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>Soluzione LPS</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 coniugato ZO-1 Anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>Diluente per anticorpi OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi CCK-8</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rosso CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio in vetro</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto glucosio</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Basi essiccatore con flangia piana, filettatura</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Coperchio essiccatore in vetro e Rubinetto</td><td>Daihan Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Rubinetto, con mandrino in PTFE</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>Elettrofilatoio</td><td>NanoNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, Puro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Modulo scanner confocale laser a fluorescenza K1-fluo</td><td>Nanoscope Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel/mount</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Ugello metallico 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Nature republic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Syringe_Lure plastica (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poly (acido acrilico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poly (alcol vinilico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Polycaprolattone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Pure HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica a scansione</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>scorrevole Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 set</td><td>omniscience</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lettore multimodale</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Questo protocollo delinea i passaggi critici per la cocoltura di cellule epiteliali polmonari MLE-12 e fibroblasti NIH3T3 costruendo un modello a due strati basato su membrana nanofibrosa (Figura 1). Questo modello è adatto all'imaging di cellule vive, all'immunoistochimica e all'analisi quantitativa degli endpoint delle cellule in cocoltura. Altri tipi di cellule possono essere utilizzati ottimizzando la densità cellulare e le condizioni di crescita.
Il SEM mostra la distribuzione uniforme delle nanofibre PVA fabbricate senza alcuna formazione di perline (Figura 2A). Il diametro delle nanofibre PVA variava da 150 nm a 230 nm (180 ± 25 nm, media ± deviazione standard (SD)). Le nanofibre nei PCL NM elettrofilati erano orientate in modo casuale e assomigliavano strutturalmente al collagene (Figura 2B). La maggior parte delle fibre nei PCL NM aveva un diametro compreso tra 300 nm e 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Pertanto, la membrana nanofibrosa PVA aveva pori di dimensioni inferiori rispetto alla membrana nanofibrosa PCL.
Prima della semina, le cellule MLE-12 e NIH3T3 sono state colorate rispettivamente con Cell-Tracker rosso e verde e sono state monitorate durante tutto il processo di cocoltura. Come mostrato nella Figura 3, è stato possibile osservare distintamente la distribuzione spaziale delle cellule MLE-12 nella camera di inserimento e delle cellule NIH3T3 nella camera inferiore. L'analisi del focus-stacking ha rivelato che le cellule NIH3T3 sono state disperse e rilevate a profondità variabili (102 ± 20 μm), mentre le cellule MLE-12 hanno formato strati con uno spessore di 80 ± 10 μm. Il SEM mostra l'attaccamento delle cellule alle membrane. Le cellule NIH3T3 si infiltrano nella membrana nanofibrosa del PCL e si estendono lungo gli assi delle nanofibre, mentre le cellule MLE-12 hanno aderito alla superficie della membrana nanofibrosa PVA e hanno mostrato un'aggregazione (Figura 4). Successivamente, abbiamo esaminato l'organizzazione citoscheletrica delle cellule NIH3T3 e delle cellule MLE-12 mediante colorazione con actina. Le cellule NIH3T3 coltivate su membrana nanofibrosa PCL mostrano una distribuzione a proiettile di filamenti di actina simili alle cellule nei tessuti, e la colorazione con actina nelle cellule MLE-12 coltivate su membrana nanofibrosa PVA mostra aggregati rotondi senza diffusione cellulare (Figura 5).
Sono stati confrontati la distribuzione e il modello di crescita delle cellule MLE-12 in monocoltura e cocoltura. Le cellule colorate in rosso con Cell-Tracker in monocoltura sui PVA NM hanno formato aggregati, ma le cellule in condizione di cocoltura hanno mantenuto una distribuzione uniforme sulla membrana (Figura 6A). In un'analisi 3D di immagini di microscopia confocale, il modello di crescita delle cellule MLE-12 cocoltivate sui PVA NM mostra un'adesione stratificata delle cellule coltivate alla membrana con una densità cellulare più confluente, rispetto alle cellule coltivate in assenza di fibroblasti (Figura 6B). Inoltre, l'adesione cellula-cellula e l'espressione dell'occludina zonale (ZO)-1 sulle superfici cellulari (freccia indicata), ma non degli aggregati cellulari, erano più evidenti nella condizione di cocoltura rispetto alla coltura senza fibroblasti (Figura 6C).
La proliferazione delle cellule sulle membrane è stata misurata utilizzando il test CCK-8. La proliferazione delle cellule NIH3T3 e MLE-12 è aumentata nel tempo (Figura 7). Tuttavia, sono stati osservati tassi di crescita delle cellule inferiori sulle membrane rispetto a una piastra di coltura (dati non mostrati). Le cellule NIH3T3 e MLE-12 cocoltivate su NM mostrano un tasso di crescita stabile rispetto alle cellule monocoltivate in una piastra di coltura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema per illustrare il metodo di co-coltura di fibroblasti NIH3T3 e cellule epiteliali MLE-12 nel sistema a due strati basato su scaffold. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
Figura 2: Struttura delle nanofibre di PVA e PCL. (A) Le membrane nanofibrose di PVA e (B) PCL sono state prodotte mediante elettrofilatura. La struttura e il diametro delle nanofibre sono misurati mediante SEM delle superfici della membrana. Barre di scala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
Figura 3: In un sistema di cocoltura, la distribuzione spaziale delle cellule NIH3T3 sulla membrana nanofibrosa PCL e delle cellule MLE-12 sulla membrana nanofibrosa PVA. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) sono state colorate con Cell-Tracker Green e le cellule MLE-12 (3 × 105) sono state colorate con Cell-Tracker Red. Le cellule seminate sono state coltivate per 24 ore e osservate utilizzando un'immagine Z-stacking di un microscopio confocale. I numeri sono indicati in μm; Le frecce mostrano le dimensioni con X (larghezza), Y (lunghezza), Z (profondità). Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
Figura 4: Adesione e morfologia delle cellule NIH3T3 su membrana nanofibrosa PCL e delle cellule MLE-12 su membrana nanofibrosa PVA. Le cellule sono state coltivate sulle membrane per 24 ore e osservate utilizzando il SEM con un ingrandimento di 2.000x. Barre di scala = 15 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
Figura 5: Fibre di stress di actina in cellule NIH3T3 su membrana nanofibrosa PCL e cellule MLE-12 su membrana nanofibrosa PVA. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) e le cellule MLE-12 (3 × 105 cellule) sono state seminate rispettivamente sulle membrane nanofibrose PCL e PVA. Dopo 48 ore di coltura, le cellule sono state colorate con falloidina-iFlour 488 e osservate mediante microscopia confocale. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone); FITC = isotiocianato di fluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
Figura 6: Modello di crescita di cellule MLE-12 cocoltivate su membrana nanofibrosa PVA. (A) Le cellule MLE-12 colorate in rosso Cell-Tracker (3 × 105 cellule) sono state seminate sulla membrana nanofibrosa PVA e coltivate da sole (cellule -NIH3T3) e con cellule NIH3T3 in un sistema a due strati (+cellule NIH3T3) per 48 ore. (B) Le cellule MLE-12 monocoltivate e cocoltivate per 48 ore sono state colorate con Hoechst 33342 (blu) e Phalloidin-iFlour 488 e osservate utilizzando un microscopio confocale. Le immagini 3D vengono visualizzate utilizzando la funzione di superficie del software Imaris. (C) Le cellule MLE-12 sono state coltivate per 48 ore e marcate in fluorescenza con Phalloidin-iFlour 488 e anticorpo anti-ZO-1 (rosso). Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
Figura 7: Tasso di crescita delle cellule in un sistema di cocoltura a due strati. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) e le cellule MLE-12 (3 × 105) vengono cocoltivate per il tempo indicato. La crescita cellulare nell'inserto e nel pozzetto inferiore viene misurata utilizzando il saggio CCK-8. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

I progressi nelle tecnologie dei biomateriali consentono lo sviluppo di costrutti tridimensionali di tipo multicellulare. Abbiamo sviluppato protocolli di elettrofilatura per produrre tre scaffold individuali per coltivare le principali cellule strutturali delle vie aeree per fornire un modello 3D in vitro della parete dei bronchioli delle vie aeree.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

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Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

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Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.

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Il protocollo presentato descrive lo sviluppo e l'uso di una tecnica di colorazione filamentosa-actina a base di falloidina con microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per visualizzare la struttura dello strato cellulare aderente nei canali di coltura dinamica microfluidica e nelle tradizionali camere di coltura statica a pozzo fisso. Questo approccio aiuta a valutare la confluenza dello strato cellulare, la formazione del monostrato e l'uniformità dello spessore dello strato.

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Gli inserti per colture tissutali con membrane in plastica sono lo standard d'oro nei laboratori di coltura cellulare come supporti permeabili per stabilire strati cellulari e modelli di tessuti barriera. Qui, presentiamo un metodo semplice per sostituire la membrana di plastica con una membrana biologicamente più rilevante costituita da una proteina di seta di ragno funzionalizzata ricombinante.

Mimic della membrana basale nanofibrillare in seta di ragno funzionalizzata ricombinante in inserti di coltura tissutale su misura

Un nuovo protocollo di sigillatura per produrre sigilli impermeabili a base di silicone per membrane di dispositivi a chip polidimetilsilossano (PDMS). Destinato a laboratori, configurazione di modelli di chip e sviluppo di piattaforme chip su piccola scala. Dimostriamo il protocollo utilizzando membrane tissutali plastiche e native. Questa procedura richiede solo PDMS, toluene, muffa, membrana e una camera a vuoto.

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Scopri come sviluppare un sistema di cocoltura 3D con membrane nanofibrose di PVA e PCL per l'ingegneria tissutale. Questo metodo supporta l'adesione e la crescita di cellule epiteliali e fibroblasti, migliorando lo studio delle interazioni cellulari.

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