Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Il nostro gruppo di ricerca utilizza alcol polivinilico, PVA e poli epsilon-caprolattone, PCL, membrane nanofibrose per sviluppare un sistema di cocoltura 3D. Mira a rispondere al modo in cui le membrane supportano le cellule epiteliali e dei fibroblasti, imitano gli ambienti tissutali e facilitano lo studio dei patterning, delle segnalazioni e delle interazioni cellulari. Dimostreremo che le membrane nanofibrose porose elettrofilate consentono alle cellule epiteliali di formare tessuto epiteliale, consentendo ai multistrati e ai fibroblasti di crescere in ogni matrice aggiuntiva.

I metodi evidenziano come un sistema 3D espanso possa fornire ai tessuti in crescita ambienti migliori rispetto alle colture tradizionali e 2D. Offriamo un sistema di cocoltura che impiega cellule epiteliali differenziate. L'organizzazione utilizzando le cellule staminali richiede una complessa procedura di differenziazione, ma il nostro modello presenta vantaggi in termini di semplicità e risparmio di tempo nello sviluppo di un sistema di cocoltura 3D.

Ci concentriamo sul superamento dei limiti degli scaffold nanofibrosi combinando membrane nanofibrose con idrogel sopra strato nelle cocolture. Per iniziare, aggiungi 0,02 grammi di acido poliacrilico e un grammo di PVA a una bottiglia di vetro pulita contenente una barra magnetica. Aggiungere 7,8 millilitri di acqua distillata alla bottiglia, quindi posizionare la bottiglia su un agitatore a piastra.

Una volta che la bottiglia si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 0,2 millilitri di glutaraldeide e rimetterla sull'agitatore a piastre a 500 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per l'elettrofilatura. Separare gli stantuffi dai fusti e pulire i piccoli detriti di plastica all'interno dei fusti e le punte degli stantuffi.

Quindi, usa gli aghi per bloccare il flusso del liquido e versa la soluzione PVA in ogni cilindro della siringa. Montare gli stantuffi nei fusti e rimuovere gli aghi. Dopo aver assemblato un nuovo ago di metallo calibro 27, posizionarlo nell'elettrofilatoio.

Avvolgere strettamente il collettore con un foglio di alluminio. Una volta che il pannello dell'iniettore ritorna nella sua posizione originale, impostare l'elettrofilatore su un volume di iniezione di due millilitri, una velocità di iniezione di sei microlitri al minuto, una velocità del rullo di 100 giri/min e una distanza tra la punta e il collettore di 14 centimetri. Controllare il flusso di liquido per ogni pompa, quindi far funzionare l'elettrofilatoio con un potenziale elettrico di circa 12 kilovolt.

Al termine del processo di elettrofilatura, staccare la pellicola contenente il tappetino in fibra dal collettore. Conservare il tappetino in nanofibra in un essiccante sotto vuoto. Aggiungi 1,5 grammi di PCL e 8,5 millilitri di cloroformio in una bottiglia di vetro pulita.

Posizionare il flacone su un agitatore a piastre e sciogliere il PCL nel cloroformio per 12 ore a temperatura ambiente. Tagliare un piccolo pezzo della membrana in nanofibra, rivestire i pezzi con un sottile strato d'oro utilizzando il processo di sputtering automatico per cinque minuti. Per iniziare, tagliare il tappetino in nanofibra PVA fabbricato in pezzi della dimensione desiderata per l'inserto del pozzetto.

Preparare un piattino contenente 1,5 millilitri di acido cloridrico puro. Posizionare il piatto con l'acido cloridrico e i pezzi di nanofibra all'interno di una camera a vuoto e chiudere il coperchio. Quindi aprire la valvola collegata alla pompa del vuoto e attendere 10 secondi fino a quando i fumi dell'acido cloridrico non salgono.

Chiudere la valvola e trattare le membrane con fumi di acido cloridrico per due minuti. Dopo il trattamento con acido cloridrico, aggiungere gocce di acqua distillata alle membrane. Posizionare le membrane su un vetrino e rimuoverle dalla pellicola.

Usa un rivestimento automatico per polverizzare per rivestire le membrane su nastro di carbonio con un sottile strato d'oro. Quindi lavare tre volte le nanomembrane PVA reticolate con acido cloridrico con PBS e immergerle nel terreno di coltura. Dopo l'immersione, controllare il pH per confermare l'assenza di acido cloridrico residuo.

Per iniziare, taglia i tappetini in nanofibra in pezzi rotondi con un diametro di 10 millimetri per le nano membrane PVA e 13 millimetri per le nano membrane PCL. Miscelare la base SYLGARD 184 e l'agente indurente in un rapporto di massa di 10 a uno in un bicchiere di plastica. Utilizzare un vetrino pulito per mescolare energicamente la soluzione di polidimetilsilossano, o PDMS, per due o tre minuti fino a quando non si formano delle bolle.

Stendere uniformemente il PDMS su un vetrino. Immergere leggermente il bordo inferiore dell'inserto nel PDMS. Quindi posizionare l'inserto ben capovolto sullo scaldavetrini per 10-15 minuti fino a quando il PDMS non si indurisce.

Controllare il PDMS con un puntale per pipetta da 200 microlitri per assicurarsi che non sia più appiccicoso. Ora, premere delicatamente l'inserto sul pezzo di nanomembrana PVA, in modo che il fondo dell'inserto sia rivolto verso il lato della membrana in nanofibra. Aggiungi una goccia di acqua distillata al centro del pozzo e usa una pinza per rimuovere con cura la pellicola.

Quindi posizionare bene l'inserto in una nuova piastra a 24 pozzetti e lasciare asciugare la membrana. Quando si collega il pezzo di membrana nano, immergere un puntale per pipetta da 200 microlitri nella miscela PDMS e picchiettarlo con precisione ai quattro angoli e al centro del pozzetto. Posizionare la piastra sullo scaldavetrini e lasciare indurire il PDMS per cinque-sette minuti.

Quindi, posizionare il pezzo di nanomembrana PCL nel PDMS contenente bene con il lato in nanofibra attaccato al PDMS. Utilizzare una piccola spazzola pulita per premere leggermente il lato della lamina della membrana per un fissaggio completo. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di etanolo al 70% nel pozzetto per facilitare la rimozione della pellicola.

Sterilizzare l'inserto e il pozzetto inferiore nella configurazione del pozzetto sotto la luce ultravioletta durante la notte. Il giorno successivo, lavare bene l'inserto e il fondo aggiungendo 200 microlitri di PBS all'inserto e 500 microlitri al pozzetto del fondo per tre cicli da 10 minuti ciascuno. Una volta che le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, lavarle con 10 millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% per tripsinizzarle.

Picchiettare delicatamente il piatto per rimuovere le celle dal fondo. Aggiungere otto millilitri di terreno di coltura completo per neutralizzare l'enzima tripsina, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 400 G per cinque minuti.

Dopo aver scartato il sopra natante, risospendere il pellet di cella in cinque millilitri di DMEM completo con terreno F12. Quindi riempire il pozzetto inferiore con 500 microlitri di media DMEM F12 completo. Trasferire l'inserto attaccato alla membrana nanofibrosa PVA nel pozzetto e aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare MLE-12.

Quindi, riempire il pozzetto inferiore attaccato alla membrana nanofibrosa PCL con 500 microlitri di sospensione cellulare NIH3T3. Dopo aver incubato le cellule per due ore, assemblare la cellula MLE-12 contenente l'inserto e la cellula NIH3T3 contenente il pozzetto inferiore nella configurazione transwell, La distribuzione spaziale delle cellule NIH3T3 e delle cellule MLE-12 nel sistema di cocoltura era chiaramente distinguibile, con cellule NIH3T3 verdi disperse a profondità variabili e cellule MLE-12 rosse che formavano strati. Le cellule NIH3T3 si infiltrano nella membrana nanofibrosa del PCL e si estendono lungo gli assi delle nanofibre, mentre le cellule MLE-12 aderiscono alla superficie della membrana nanofibrosa del PDA e mostrano un'aggregazione.