Name: Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara a misurare il modulo di Young delle membrane basali polmonari murine mediante microscopia a forza atomica e criosezionamento. Questo metodo preserva le proprietà meccaniche native e aiuta a studiare l'invasione delle cellule tumorali.

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<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Siringa Injekt-F</td></tr><tr><td>da 10 mL</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Provetta Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>provetta con tappo a vite</td></tr><tr><td>Cantilever - MLCT</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>3444</td><td>AFM cantilever con forma di punta piramidale</td></tr><tr><td>Lame per criotomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>Lame monouso a basso profilo DB80LX</td></tr><tr><td>Portacampioni per criotomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>Disco per campioni 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension Bruker</td><td></td><td></td><td>Software Estensione per il software JPK SPM che consente di importare l'immagine ottica del microscopio invertito nel visualizzatore di dati del software SPM.</td></tr><tr><td>Stampo di base monouso</td><td>Servizi scientifici</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>Nastro per pellicola fotografica</td></tr><tr><td>Supporto a sbalzo a molla fissa Bruker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito - Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Motorized Stage</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Microscopio Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Versione R2024a o superiore</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Toolbox per l'elaborazione delle immagini</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Toolbox per l'elaborazione dei segnali&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Cassetta degli attrezzi per la statistica e l'apprendimento automatico</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Vetrini per microscopio semplici per calibrazione a sbalzo</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio - bordo smerigliato</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Vetrini per microscopio con bordo smerigliato per criosezione</td></tr><tr><td>Ago &oslash; 0,9 mm & volte; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT iniezione&nbsp; nel campione polmonare</td></tr><tr><td>Ago &oslash; 0,9 mm & volte; 70 mm</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>Ago lungo per applicare PBS sotto il</td></tr><tr><td>composto AFM OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. Composto</td></tr><tr><td>fosfato tamponato soluzione salina</td><td>Bio& Vendi</td> la soluzione <td>PBS BS.L1825</td><td>senza Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension Bruker</td><td></td><td></td><td>Software Estensione per il software JPK SPM che fornisce per ogni pixel dell'immagine registrata l'intera curva di forza sottostante.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>Forbici da bisturi monouso chirurgiche</td></tr><tr><td></td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>Forbici precise 13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Nastro monoadesivo</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>nastro trasparente, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Scatola per vetrini</td><td>GWL Sistemi di conservazione</td><td>K50W</td><td>Scatola per diapositive per 50 vetrini</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio - Stemi DR1663</td><td>Pinzette Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione del modulo di young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Dopo l'identificazione e la misurazione di una parete alveolare intatta, l'esito primario di questo protocollo è il filtraggio dei valori del modulo di Young del midollo osseo. È importante notare che non è possibile trovare una parete alveolare adatta per la misurazione dell'AFM in ogni sezione di tessuto. Nelle nostre osservazioni sperimentali, circa il 75% delle criosezioni derivate da campioni polmonari murini mostrava una parete alveolare quantificabile. Per determinare con precisione la distribuzione spaziale del modulo di Young in un midollo osseo polmonare, si consiglia di utilizzare mappe di forza che si estendono su 3 μm x 3 μm o 4 μm x 4 μm. Questo approccio garantisce una risoluzione sufficiente per l'esame dei BM polmonari di topo, che in genere misurano 100 nm - 200 nm di spessore. Pertanto, l'approccio sperimentale prevede l'acquisizione di curve di forza 50 x 50 per ciascuna mappa di forza, producendo un totale di 2.500 curve di forza. All'interno della mappa delle forze, le curve delle forze sono equidistanti. Ciò implica che, oltre al modulo di Young del midollo osseo, le strutture tissutali che circondano il midollo osseo vengono sondate anche nelle mappe di forza piccole. Pertanto, per determinare in modo accurato e selettivo il modulo di Young esclusivamente del midollo osseo polmonare, abbiamo implementato un processo di filtraggio in due fasi in questo protocollo.
La fase iniziale del filtraggio spaziale dipendente dall'operatore seleziona i risultati dell'adattamento della curva di forza originati dal midollo muscolare polmonare murino, comprendendo circa il 10-25% dei valori totali dei risultati contenuti nella mappa di forza analizzata. Dopo questo filtraggio spaziale iniziale, vengono conservati circa 250 - 625 risultati di adattamento per ulteriori analisi. La successiva fase di filtraggio garantisce che siano inclusi solo i risultati relativi al midollo osseo originati dalle curve di forza adeguatamente descritte dal modello di Hertz modificato. Pertanto, il coefficiente di determinazione (R2) dell'adattamento del modello di Hertz modificato viene utilizzato come criterio di filtro. La nostra esperienza empirica suggerisce che mantenere i risultati con valori di R2 superiori a 0,96 è adatto per i risultati di adattamento ottenuti aderendo a questo protocollo. È importante notare che il valore R2 è influenzato in modo significativo dalla qualità (levigatezza) e dalla lunghezza della linea di base della curva di forza, dalla determinazione del punto di contatto e dalla convergenza del modello adattato. Dopo l'applicazione di entrambe le procedure di filtraggio, rimangono tipicamente da 100 a 500 valori del modulo di Young per il BM di una singola parete alveolare.
La distribuzione di questi valori rimanenti del modulo di Young dal midollo osseo può essere visualizzata utilizzando un istogramma (Figura 4A). È importante notare che i valori del modulo di Young risultanti del midollo mitralico polmonare seguono una distribuzione log-normale, che è comunemente osservata per variabili casuali che possono raggiungere solo valori positivi61. Questo è visualizzato dal grafico QQ nella Figura 4B. Di conseguenza, una distribuzione normale (gaussiana) può essere adattata alla distribuzione dei valori del modulo di Young (E) logaritmicamente trasformati. Qui, il logaritmo naturale (ln) è stato utilizzato per trasformare i valori E . La posizione di picco della distribuzione (μ) e la deviazione standard (σ) sono state estratte da questo adattamento e successivamente ritrasformate per ottenere il modulo di Young rappresentativo, indicato come EBM, utilizzando la seguente equazione:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
Si noti che dopo la ritrasformazione, l'intervallo di deviazione standard non è più simmetrico attorno al valore di picco. Gli archi negativi (σ-) e positivi (σ+) dell'intervallo di deviazione standard possono essere calcolati utilizzando le seguenti espressioni:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
Queste equazioni sono una conseguenza del fatto che la funzione esponenziale è la funzione inversa del logaritmo naturale62.
Dopo aver ritrasformato il valore di picco μ = 9,31 e la deviazione standard σ = 0,18 determinata dall'istogramma nella Figura 4A, il valore rappresentativo del modulo di Young è EBM = 11,05 kPa con un intervallo di deviazione standard di [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. In alternativa, una distribuzione log-normale può essere adattata all'istogramma dei valori del modulo di Young (E) non trasformati per determinare i parametri caratteristici della distribuzione.
Si raccomanda che almeno quattro pareti per topo siano analizzate per ottenere un risultato rappresentativo robusto, come abbiamo mostrato in dettaglio in Hartmann et al.59. Per determinare il modulo di Young rappresentativo EBM per un topo, i valori trasformati logaritmicamente di tutte e quattro le pareti sono stati tracciati in un istogramma combinato e μ e σ sono stati determinati adattando una distribuzione normale. Successivamente, μ e σ vengono ritrasformati come descritto in precedenza per recuperare EBM e l'intervallo di deviazione standard per il topo in questione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
Figura 1: Panoramica delle principali fasi del protocollo per determinare il modulo di Young di una membrana basale polmonare murina. La fase iniziale prevede l'ottenimento e la preparazione dei polmoni murini, seguiti dall'incorporamento. Pertanto, il polmone viene iniettato con una combinazione di terreno OCT e PBS e quindi completamente immerso nel composto OCT. Successivamente, vengono ottenute sezioni di tessuto polmonare spesse 15 μm mediante criosezione con un criotomo. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio il processo di utilizzo di nastri adesivi unilaterali e biadesivi per fissare i campioni in posizione durante il processo di taglio. Successivamente, i valori del modulo di Young del BM vengono determinati attraverso misure della mappa di forza AFM sulle sezioni di tessuto. Dopo il completamento del processo di analisi della curva di forza, viene applicato il filtraggio spaziale e R² per isolare i risultati del modulo di Young della struttura di interesse, in particolare il BM (mostrato in verde nella mappa di forza e quantificato nella distribuzione del modulo di Young log-trasformato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
Figura 2: Un esperimento esemplare di AFM con mappa di forza condotto su una sezione di tessuto polmonare murino. (A) Immagine panoramica al microscopio a campo chiaro di una sezione di tessuto polmonare murino, che consente l'identificazione di pareti alveolari intatte situate tra due alveoli. Sul lato destro dell'immagine, è visibile il cantilever F MLCT di forma triangolare dell'AFM. (B) Vista ingrandita di una parete selezionata all'interno della sezione di tessuto. (C) Canale di pendenza e (D) altezza di una mappa panoramica 15 x 15 μm contenente curve di forza 50 x 50 della parete alveolare. Nel canale di pendenza, il BM può essere identificato come una linea luminosa (freccia bianca), che indica una struttura di maggiore rigidità all'interno della parete. Il canale di altezza conferma l'integrità della parete, non mostrando segni di rottura. Dopo l'identificazione del BM nella mappa panoramica 15 x 15 μm, viene registrata una mappa più piccola di 4 x 4 μm (E: canale di pendenza, F: canale di altezza) con curve di forza 50 x 50. Barre di scala: (A) 200 μm e (B-D) 25 μm. Le gamme delle scale di colori delle immagini AFM mostrate sono (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (immagine panoramica) e 2,42 - 8,37 nN/μm (immagine più piccola), (F) 0 - 3,38 μm (immagine panoramica) e 0 - 1,99 μm (immagine più piccola), da scuro a luminoso. Le scale di colori lineari sono state utilizzate per tutte le immagini AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
Figura 3: Visualizzazione della procedura di filtraggio spaziale. (A) La mappa del modulo di Young risultante dall'analisi della curva di forza, come mostrato nello strumento di filtraggio dei risultati per abilitare il filtraggio spaziale dei risultati. Il midollo osseo è identificabile come una striscia luminosa (valori elevati del modulo di Young) circondata da compartimenti tissutali più morbidi. (B) Istogramma dei valori del modulo di Young corrispondenti alla mappa non filtrata (A). Dopo l'applicazione (C) della maschera di filtro spaziale (area verde), (D) l'istogramma comprende esclusivamente i valori del modulo di Young dalla regione evidenziata in verde, che è stata identificata come BM. Si noti che i valori morbidi residui osservabili sul lato sinistro dell'istogramma possono essere attribuiti a fit scarsamente convergenti, che verranno eliminati nella successiva fase di filtraggio R². <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribuzione del modulo di Young di un midollo muscolare polmonare murino ricevuto seguendo questo protocollo. (A) Istogramma logaritmizzato dei valori del modulo di Young del midollo osseo risultante (N = 325). Adattando una distribuzione normale (linea continua nera), viene determinato il valore medio μ = 9,31 con una deviazione standard di σ = 0,18. Dopo la ritrasformazione, questo corrisponde a un modulo di Young del BM di EBM = 11,05 kPa con un intervallo di deviazione standard asimmetrico di [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Grafico dei quantili dei valori del modulo di BM Young logaritmizzati rispetto ai quantili di una distribuzione normale standard. Questo grafico dimostra che, con l'eccezione di alcuni valori nelle code sinistra e destra della distribuzione, i valori del modulo di Young risultanti sono principalmente distribuiti log-normale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal

Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

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