Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

Questa ricerca si è concentrata sullo sviluppo di un sistema di coltura 3D per la crescita dei follicoli in vitro e la maturazione degli ovociti. La creazione di un tale sistema utilizzando componenti della matrice extracellulare nativa di una cellula migliorerà lo sviluppo dei follicoli. La sfida più grande è applicare le conoscenze dei modelli animali alla coltura dei follicoli umani.

L'accesso al tessuto ovarico umano è limitato. E i follicoli umani richiedono un tempo significativamente più lungo in coltura per raggiungere la maturazione degli ovociti. Il modello di coltura 3D sviluppato in questo studio può essere particolarmente utile per la coltura di follicoli ovarici umani, consentendo la conservazione dell'architettura 3D durante il tempo prolungato necessario nella coltura per la maturazione degli ovociti.

Per iniziare, ottenere ovaie da 10 a 14 giorni di cuccioli di topo B6D2F1 per la procedura. Pipettare 6 millilitri di terreno di coltura follicolare pre-equilibrato, o FCM, in due piastre da 60 millimetri e sovrapporle con olio minerale e incubare. Pipettare 1 millilitro di collagenasi nel pozzetto centrale del piatto e 3 millilitri di tessuto ovarico, o media OT, nel pozzetto esterno.

Spostare le ovaie nella soluzione di collagenasi. Al termine dell'incubazione della collagenasi, spostare le ovaie trattate con collagenasi verso il pozzetto esterno per risciacquare. Cambiare le micropipette e trasferire le ovaie in un piatto fresco riempito con terreno OT.

Per prelevare i follicoli, aspirare ed espellere ripetutamente il tessuto ovarico trattato con enzimi attraverso puntali di pipette tagliati a diverse dimensioni. Stuzzicare meccanicamente il tessuto utilizzando aghi da 27 gauge per il rilascio di otto follicoli. Esamina al microscopio da dissezione con un ingrandimento di 40x e raccogli i follicoli preantrali secondari con un ovocita posizionato centralmente racchiuso all'interno di una membrana basale intatta in un piatto OT fresco.

Posizionare la capsula FCM2 nell'incubatrice per 60 minuti prima di iniziare il processo di inclusione. Preparare due gocce da 25 microlitri di gel HA senza perossido di idrogeno sul coperchio per il risciacquo. Spostare i follicoli o i gruppi di follicoli da incorporare dalla piastra FCM a una goccia di acido ialuronico, o gel HA, per risciacquare il terreno di coltura.

Riposizionare la parabola FCM sotto il gorgogliatore per gassare. Per incorporare i follicoli, posizionare 1 microlitro di goccia di perossido di idrogeno allo 0,03% sul coperchio di un piatto da 60 millimetri. Ora, aggiungi 25 microlitri di gel HA da 3 millilitri per millilitro e mescola.

Pipettare circa 8-10 microlitri della miscela di perossido di idrogeno HA in due pozzetti separati della piastra di coltura a otto pozzetti. E trasferisci rapidamente i follicoli, i gruppi di follicoli o i frammenti di tessuto ovarico al centro di ogni goccia. Assicurati che non ci siano bolle all'interno della goccia.

Dopo tre minuti, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura follicolare preequilibrato in ciascun pozzetto. Sovrapporre con olio minerale caldo preequilibrato e incubare il piatto. Preparare le attrezzature e le soluzioni necessarie per il processo di vetrificazione.

Posizionare il portatore RI nella fessura della scatola criogenica contenente azoto liquido. Mettere due gocce di soluzione di vitrificazione preriscaldata 1, o VS1, una accanto all'altra sul coperchio di un piatto da 60 millimetri vicino alla parte superiore. Ora, posiziona due follicoli nella prima goccia, risciacqua e spostali rapidamente nella seconda goccia di VS1 per un'incubazione di cinque minuti.

Mentre i follicoli incubano, fare tre gocce VS2 appena sotto le gocce VS1. Quindi spostare rapidamente i follicoli in sequenza attraverso le tre gocce VS2 entro 60 secondi. Per la vitrificazione, prelevare i follicoli da VS2.

Visualizzare il portatore dell'istanza riservata nell'ambito di dissezione. E regola la messa a fuoco per visualizzare il piccolo foro nel bastoncino di plastica. Depositare i follicoli con una quantità minima di liquido nel foro.

Immergi il bastoncino di plastica nella cannuccia esterna preraffreddata. E usa un sigillante ad ultrasuoni per chiudere la cannuccia. Metti la cannuccia in un calice attaccato alla canna criogenica.

Copri la canna con una guaina protettiva di plastica e immergila nell'azoto liquido. Per la vetrificazione a supporto aperto, preparare il supporto inserendo lo stelo metallico CL nel tappo del flaconcino magnetizzato, garantendo una presa salda. Posizionare un rack nella scatola criogenica per contenere le fiale criogeniche, assicurandosi che l'azoto liquido sia al di sotto della parte superiore delle fiale.

Riempi una fiala criogenica inventata magnetizzata con azoto liquido e mettila nella griglia. Afferrare il supporto aperto CL per il cappuccio magnetico attaccato utilizzando una bacchetta magnetica. Immergere il supporto CL in una goccia separata di VS2 per creare un film crioprotettivo.

Raccogliere tutti i follicoli o i gruppi di follicoli e posizionarli sulla pellicola con una quantità minima di liquido. Immergere immediatamente il CL nella fiala criogenica riempita con azoto liquido per vitificare il campione. Posizionare la fiala criogenica sulla canna criogenica, quindi coprire con un manicotto di plastica.

Immergere la canna in un serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido. Preparare un piatto centrale con 3 millilitri di FCM preequilibrato nel pozzetto esterno e 1 millilitro nel pozzetto centrale. Dopo aver ricoperto il mezzo con l'olio, posizionare il piatto sotto il gorgogliatore per gasare.

Mettere 0,5 millilitri di soluzioni riscaldanti WS1 e WS2 preequilibrate a 37 gradi Celsius in due piatti a pozzetto centrale etichettati. Spostare le canne criogeniche con i campioni dal serbatoio di stoccaggio in una scatola criogenica riempita con azoto liquido. Per prima cosa, rimuovi il coperchio della canna di plastica.

Quindi, mantenendo la cannuccia immersa, rimuoverla dal calice e farla scorrere nella fessura di supporto nella scatola criogenica. Taglia la cannuccia esterna appena sopra il punto nero. Solleva il bastoncino di plastica interno dalla cannuccia esterna e immergi rapidamente il bastoncino in WS1, roteando delicatamente per scaricare i follicoli entro 10 secondi.

Dopo due minuti in WS1, utilizzare una micropipetta per trasferire i follicoli o i gruppi di follicoli in WS2 per un'incubazione di tre minuti. Quindi trasferirli in un piatto FCM e incubare i follicoli per una o due ore al centro bene prima di incorporarli, per il riscaldamento del CL a vettore aperto, ripetere la preparazione del piatto FCM e WS. Trasferisci la canna criogenica in una scatola criogenica e rimuovi il coperchio della canna di plastica.

Utilizzare una bacchetta magnetica per sollevare il tappo della fiala criogenica finché lo stelo metallico del CL non è visibile. Afferrare il cappuccio con il supporto CL montato utilizzando la bacchetta magnetica. E immergi rapidamente il CL in WS1, roteando per scaricare i follicoli entro 10 secondi.

La crescita del follicolo preantrale è stata mantenuta nella coltura tridimensionale di gel di acido ialuronico, preservando l'architettura del follicolo nativo con un antro visibile entro il giorno 12. I follicoli incapsulati in gel di acido ialuronico hanno mostrato un'espansione radiale dovuta alla proliferazione cellulare della granulosi con diametri dei follicoli che sono aumentati da circa 139,8 micrometri a 385,6 micrometri durante il periodo di coltura. Metafase ovulata due ovociti sono stati trovati vicino al follicolo dopo l'innesco della gonadotropina corionica umana.

Gli ovociti misuravano circa 84,8 micrometri di diametro. Con le ovaie fresche, sia i singoli follicoli che i gruppi di follicoli hanno mostrato buoni tassi di maturazione. I cluster di follicoli provenienti da ovaie crioconservate hanno mostrato tassi di maturazione più bassi che portano all'estrusione prematura degli ovociti.

La crioconservazione del follicolo isolato è risultata più efficace della conservazione dell'ovaio intero. La vitrificazione dei follicoli su entrambi i vettori ha raggiunto alti tassi di maturazione, indipendentemente dalle differenze di velocità di raffreddamento. Il sistema di trasporto aperto CL ha consentito un'efficiente crioconservazione di più follicoli, riducendo i tempi di lavorazione.