Name: Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Scopri la coltura tridimensionale di follicoli ovarici di topo con idrogel di acido ialuronico e le tecniche di vitrificazione per la crioconservazione. Questo metodo supporta la maturazione ovocitaria in vitro.

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<ol><li>Telfer, E. E., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+maturation+of+primordial+follicles+and+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and maturation of primordial follicles and immature oocytes.</a> Fertil Steril. 115 (5), 1116-1125 (2021).</li>
<li>Telfer, E. E., McLaughlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Natural history of the mammalian oocyte.</a> Reprod Biomed Online. 15 (3), 288-295 (2007).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+follicle+growth+supports+human+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation.</a> Sci Rep. 5, 17323(2015).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Dev Biol. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Diaz, F. J., Wigglesworth, K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+are+required+for+the+preantral+granulosa+cell+to+cumulus+cell+transition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes are required for the preantral granulosa cell to cumulus cell transition in mice.</a> Dev Biol. 305 (1), 300-311 (2007).</li>
<li>Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocytes+regulate+metabolic+cooperativity+between+granulosa+cells+and+oocytes%3A+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport.</a> Biol Reprod. 73 (2), 351-357 (2005).</li>
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<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).</li>
<li>Joo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+collagen+hydrogel+on+3D+culture+of+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">The effect of collagen hydrogel on 3D culture of ovarian follicles.</a> Biomed Mater. 11 (6), 065009(2016).</li>
<li>Telfer, E., Torrance, C., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+cultured+preantral+ovarian+follicles+of+mice+after+transplantation+under+the+kidney+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Morphological study of cultured preantral ovarian follicles of mice after transplantation under the kidney capsule.</a> J Reprod Fertil. 89 (2), 565-571 (1990).</li>
<li>Torrance, C., Telfer, E., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+development+of+isolated+mouse+pre-antral+follicles+in+collagen+gel+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture.</a> J Reprod Fertil. 87 (1), 367-374 (1989).</li>
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<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+on+an+agarose+matrix+improves+the+developmental+competence+of+porcine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes.</a> Theriogenology. 157, 7-17 (2020).</li>
<li>Zaniker, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionally+printed+agarose+Micromold+supports+scaffold-free+mouse+ex+vivo+follicle+growth%2C+ovulation%2C+and+luteinization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionally printed agarose Micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization.</a> Bioengineering. 11 (7), 719(2024).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).</li>
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<li>Wu, J., Nayudu, P. L., Kiesel, P. S., Michelmann, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone+has+a+stage-limited+effect+on+preantral+follicle+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone has a stage-limited effect on preantral follicle development in vitro.</a> Biol Reprod. 63 (1), 320-327 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Marcato con anti-alfa tubulina FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2168</td><td></td></tr><tr><td>Marcato con anti-beta tubulina FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2043</td><td></td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto centrale</td><td>Fisher Scientifico</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo I</td><td>Società biochimica Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di Crycap ventilata</td><td>Ricerca Hampton</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Criociclo</td><td>Ricerca Hampton</td><td>HR4-974</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in cristallo</td><td>Ricerca Hampton</td><td>HR4-733</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura 60mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>R & Sistemi D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>293237</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino-calore inattivato</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Ormone follicolo-stimolante (FSH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Globale-Hepes&nbsp; Medio</td><td>CooperChirurgico</td><td>LGGH-100</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana (hCG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>CooperChirurgico</td><td>GHSA-125</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>CooperChirurgico</td><td>ART-4007-A</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Farmacia CVS Inc.</td><td>372441</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selenio (ITS)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medio (L-15)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Ormone luteinizzante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Bacchetta magnetica</td><td>Ricerca Hampton</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (1000 & micro; m)</td><td>Minitubo</td><td>19025/0050</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (175 , 200 e 275&micro; m)</td><td>CooperChirurgico</td><td>MXL3-175, MXL3-200, MXL3-275</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millex GV 0,22 & micro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGU033RS</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>CooperChirurgico</td><td>LGOL-500</td><td></td></tr><tr><td>Minimo Terreno Essenziale alfa (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>32561-037</td><td></td></tr><tr><td>sistema di imaging per ovociti-Spindleview</td><td>Hamilton Thorne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Rapido i</td><td>VitroLife</td><td>14406</td><td></td></tr><tr><td>Scatola intelligente</td><td>VitroLife</td><td>14423</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto proteico sintetico (SPS)</td><td>CooperChirurgico</td><td>ART-3011</td><td></td></tr><tr><td>Kit Bioidrogel ialuronano-legato alla tiramina&nbsp;</td><td>LifeCore</td><td>ITA-00151</td><td></td></tr><tr><td>Saldatrice ad ultrasuoni</td><td>VitroLife</td><td>14415</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura GPS universale 8x 100 & micro; l pozzi</td><td>CooperChirurgico</td><td>UGPS-010</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

Application of a Novel Hyaluronan Hydrogel for Three-Dimensional Follicle Culture and Methodology for Mouse Ovarian Follicle Cryopreservation

Questo articolo descrive in dettaglio la metodologia per l'utilizzo di un nuovo gel di acido ialuronico legato alla tiramina per la coltura in vitro di follicoli preantrali di topo36,37. La Figura 6 illustra le differenze tra la crescita del follicolo preantrale quando viene inserito in un sistema di coltura 2D convenzionale rispetto a un singolo follicolo incapsulato in gel HA per la coltura 3D. L'architettura del follicolo nativo viene mantenuta durante i 12 giorni di coltura con un antro chiaramente visibile l'ultimo giorno di crescita.
Il gel HA è molto versatile, consente la crescita di follicoli isolati singolarmente o in gruppi e anche il tessuto ovarico viene spezzato meccanicamente in piccoli gruppi di follicoli. Il gel è trasparente, rendendo possibile la visualizzazione dei follicoli anche se a profondità diverse. I follicoli incapsulati e FL-C mostrano un'espansione radiale dovuta alla continua proliferazione delle cellule della granulosa (Figura 7). I diametri iniziali dei follicoli sono in media di 139,8 ± 28 μm con il diametro dell'ovocita GV che misura 63,5 ± 4,6 μm. Nei follicoli coltivati singolarmente, i diametri finali misurano circa 385,6 ± 36,7 μm, un aumento di circa 3 volte delle dimensioni. Gli ovociti ovulati in metafase II misurano circa 84,8 ± 3,8 μm. All'interno dei cluster FL in coltura, la dimensione dei follicoli è abbastanza varia (Figura 5, Figura 7). Gli ovociti ovulati dopo l'innesco dell'hCG si trovano vicino al follicolo (Figura 8). La maggior parte degli ovociti della metafase II sarà recuperata dai COC ovulati. I follicoli ancora incorporati dopo l'attivazione di solito contengono ovociti GV e metafase I.
La Tabella 1 mette a confronto i tassi di maturazione tra follicoli isolati e cluster FL da ovaie fresche o congelate. La FL-C delle ovaie crioconservate aveva tassi di maturazione significativamente più bassi. Le osservazioni microscopiche hanno mostrato che hanno spesso la lamina basale rotta, rendendoli abbastanza suscettibili all'estrusione prematura degli ovociti. La natura fragile dei cluster follicolari è stata in qualche modo contrastata dall'incapsulamento. Il trattamento con collagenasi delle ovaie crioconservate è stato evitato in quanto era particolarmente dannoso con bassa sopravvivenza e bassa resa di follicoli intatti.
La crioconservazione dei follicoli isolati è molto più efficace della conservazione dell'ovaio intero. Elevati tassi di maturazione possono essere raggiunti con entrambi i metodi di vitrificazione esaminati (Tabella 2). Nonostante le grandi differenze nelle velocità di raffreddamento, la maturazione degli ovociti dopo l'IVC non differiva. Il supporto aperto CL consente una maggiore efficienza in quanto è possibile caricare fino a dieci follicoli su un singolo supporto aperto CL. Ciò riduce anche il tempo complessivo per il recupero di più follicoli crioconservati. Tuttavia, per qualsiasi eventuale applicazione clinica della vitrificazione per i follicoli umani, può essere preferibile il sistema chiuso e sigillato.
La disposizione della cromatina attorno al nucleolo dell'ovocita GV può essere utilizzata per identificare gli ovociti che hanno maggiori probabilità di fecondare dopo l'ovulazione e svilupparsi in blastocisti38. La Figura 9 illustra la colorazione in tempo reale degli ovociti per visualizzare il modello di distribuzione della cromatina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig01.jpg"> Figura 1: Schema della crescita dei follicoli. Questo diagramma illustra le diverse fasi dello sviluppo del follicolo, da un follicolo primario allo stadio preantrale secondario e infine a un follicolo terziario completamente maturo pronto per l'ovulazione. Viene anche mostrata un'immagine microscopica di un tipico follicolo preantrale con le sue diverse caratteristiche morfologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig02.jpg"> Figura 2: Schema del metodo di incapsulamento HA. La struttura del gel di acido ialuronico e le diverse fasi per l'inclusione dei follicoli sono illustrate in questo diagramma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig03.jpg"> Figura 3: Isolamento e incapsulamento del follicolo. (A, B) Follicolo preantrale selezionato per l'inclusione con ingrandimento 40x e 200x. (C) Il follicolo apoptotico è mostrato con follicolo preantrale sano con ovocita non del tutto centrale. (D) Immagine di una perlina di gel HA seminata con follicoli e (E) con due FL-C. Immagini scattate con uno stereomicroscopio per mostrare l'intera perlina di gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig04.jpg"> Figura 4: Dispositivi di vetrificazione per la crioconservazione di follicoli isolati. Con il dispositivo a supporto aperto CL, la fase di vetrificazione viene condotta mediante immersione diretta dei follicoli in azoto liquido. La velocità di raffreddamento è quindi estremamente elevata, oltre i -20.000 °C/min. Al contrario, con il vettore chiuso del RI, i follicoli vengono caricati sul bastoncino di plastica interno e lasciati cadere in una cannuccia esterna immersa in azoto liquido. Questo metodo di vetrificazione chiuso evita il contatto diretto con l'azoto liquido. Tuttavia, la velocità di raffreddamento è significativamente inferiore a -1220 °C/min. Il carico e il recupero dei follicoli da entrambi i vettori è facile. Il supporto aperto CL è in grado di caricare fino a dieci follicoli per dispositivo, rispetto ai soli due del supporto chiuso RI. Questa cifra è stata modificata da35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig05.jpg"> Figura 5: Immagini rappresentative dei problemi riscontrati. (A) Ammasso di follicoli con ovocita estruso. (B) Follicoli isolati con membrana della lamina basale rotta e uno con un ovocita estruso. (C) Follicolo incorporato sotto una bolla nel gel. (D) Ammasso di follicoli che è rimasto in gel (a sinistra) rispetto a un grappolo incorporato troppo in profondità che alla fine si è attaccato al piatto. L'ampia gamma di dimensioni dei follicoli in FL-C è chiaramente visibile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig06.jpg"> Figura 6: Confronto della crescita dei follicoli nelle convenzioni 2-D rispetto alla coltura 3-D nell'HA. Con la crescita 2-D, l'appiattimento del follicolo e l'attaccamento delle cellule della granulosa alla piastra di coltura tissutale sono stati osservati entro il giorno 4, lasciando l'ovocita vulnerabile alla migrazione delle cellule della granulosa, all'interruzione delle giunzioni gap e all'estrusione prematura dell'ovocita. Il follicolo incapsulato in HA è rimasto non attaccato per tutto l'intervallo di coltura. L'espansione delle cellule della granulosa si è verificata in tutte le direzioni, racchiudendo l'ovocita e mantenendo l'architettura 3D. Questa cifra è stata modificata da36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig07.jpg"> Figura 7: Immagini rappresentative dei follicoli incapsulati in gel di acido ialuronico legato alla tiramina. (A) Follicolo preantrale raccolto dopo la digestione della collagenasi dell'ovaio fresco il giorno 1. (B) Goccia di gel seminata con quattro follicoli preantrali visualizzati il giorno 1 e (C) Giorno 4 di coltura (D) Ammasso di follicoli da ovaio fresco il giorno 2 (E) il giorno 6 e (F) il giorno 9 di coltura. (G) Ammasso di follicoli sezionato meccanicamente da ovaio intero vitrificato mostrato il giorno 2 e (H) il giorno 6 di coltura. (I) Il follicolo con formazione di antro è chiaramente visibile il 9° giorno di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig08.jpg"> Figura 8: Ovulazione dell'ovocita. (A, B) Complesso cumulo-ovocita ovulato (COC) mostrato accanto alla perlina di HA-gel. (C) Gli ovociti sono stati sottoposti a imaging dopo il trattamento enzimatico dei COC con ialuronidasi per rimuovere le cellule del cumulo circostanti. Numerosi ovociti di metafase II. (D) Ovocita in metafase II con globulo polare prominente. Ingrandimento 400x. (E) Imaging dal vivo dell'ovocita della metafase II utilizzando luce polarizzata e un sistema di imaging per visualizzare il fuso meiotico e valutare l'organizzazione, eseguito come descritto in37. Ingrandimento 400x. Normale fuso birifrangente visibile. (F) Ovocita di metafase II fissata e colorata con anti-alfa/beta-tubulina e ioduro di propidio per visualizzare l'organizzazione del fuso meiotico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig09.jpg"> Figura 9: Riorganizzazione della cromatina negli ovociti GV. La disposizione della cromatina negli ovociti GV dopo la formazione dell'antro è stata esaminata mediante colorazione del DNA con Hoechst 33342 (50 ng/mL). I follicoli rappresentativi sono stati raccolti da perle di HA mediante pipettaggio delicato. Le cellule della granulosa sono state rimosse utilizzando la ialuronidasi. Gli ovociti GV sono stati poi colorati per 15 minuti (Vedi protocollo di Monti et al.38). Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 40x. (A) Ovocita GV mostrata il giorno 1 all'inizio della coltura che mostra il pattern di colorazione della cromatina non circondata (NSN). (B) Ovocita GV dal follicolo in crescita con antro mostrato il giorno dell'innesco dell'hCG. La cromatina si condensò e formò un anello perinucleare attorno al nucleolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametro</td>
			<td colspan="2">Ovaio fresco</td>
			<td>Ovaio congelato</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FL-Isolato</td>
			<td>FL-Cluster</td>
			<td>FL-Cluster</td>
		</tr><tr><td>Follicoli osservati durante l'IVC</td>
			<td>130</td>
			<td>154</td>
			<td>69</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Ovulazione dopo HCG (%)</td>
			<td>71%</td>
			<td>66%</td>
			<td>93%</td>
		</tr><tr><td>(92/130)</td>
			<td>(101/154)</td>
			<td>(64/69)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">GVBD (%)</td>
			<td>30%</td>
			<td>28%</td>
			<td>52%</td>
		</tr><tr><td>(28/92)</td>
			<td>(28/101)</td>
			<td>(33/64)</td>
		</tr><tr><td>Formazione di ovociti MII (%)</td>
			<td>59%</td>
			<td>55%</td>
			<td>*34%</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>(54//92)</td>
			<td>(56/101)</td>
			<td>(22/64)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Risultati con follicoli inclusi in HA da ovaie fresche e vitrificate. I follicoli e l'FL-C provenienti da ovaie fresche sono stati maturati in vitro dopo l'incapsulamento in gel di acido ialuronico. Il gel HA è stato testato anche su follicoli di ovaie vitrificate utilizzando un protocollo EG/DMSO39. Con le ovaie fresche, dopo la digestione della collagenasi sono stati raccolti sia i singoli follicoli (FL) che i cluster di follicoli (FL-C). Per le ovaie vitrificate, l'esposizione alla collagenasi era, infatti, dannosa per i follicoli. L'approccio migliore con le ovaie crioconservate è stato quello di isolare i cluster FL piuttosto che i singoli follicoli e di utilizzare solo la dissezione meccanica con aghi. La tabella mette a confronto i risultati tra le perle di HA seminate con follicoli in gruppi di 4-6 rispetto alle perle con un singolo FL-C contenente 6-10 follicoli. *Il tasso di maturazione con FL-C da ovaie crioconservate è stato significativamente inferiore (p = 0,008; Analisi del chi-quadrato per verificare la significatività).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Trasportatore</td>
			<td>RI</td>
			<td>CL</td>
		</tr><tr><td>(Chiuso)</td>
			<td>(Aperto)</td>
		</tr><tr><td>Sopravvivenza (%)</td>
			<td>100% (24/24)</td>
			<td>100% (41/41)</td>
		</tr><tr><td>Formazione di antro* (%)</td>
			<td>25.0% (6/24)</td>
			<td>75.6% (31/41)*</td>
		</tr><tr><td>Tasso di ovulazione (%)</td>
			<td>66.7% (16/24)</td>
			<td>87.8% (36/41)</td>
		</tr><tr><td>Tasso di maturazione (% MII)</td>
			<td>81.3% (13/16)</td>
			<td>69.4% (25/36)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Risultati dopo crioconservazione di follicoli isolati su due diversi dispositivi di vitrificazione. Elevate velocità di maturazione sono state raggiunte sia con il dispositivo CL aperto che con il portatore RI chiuso, con la sua velocità di raffreddamento inferiore. La formazione di antro è stata l'unica misura di esito osservata per essere significativa, ma non ha influenzato il tasso di maturazione complessivo (p &lt; 0,05; Analisi del chi-quadrato per verificare la significatività).

Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

The 3-D architecture of the ovarian follicle and the complex interactions between somatic cell components and the oocyte that are necessary for ...

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Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

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