Progettazione e validazione di una biostampante ad estrusione volumetrica per la biostampa di estratto solubile di membrana basale per la ricerca traslazionale

Lo scopo di questa ricerca è la progettazione e la validazione di un sistema di bioprinting a controllo volumetrico a basso costo e lo sviluppo di un protocollo specifico per la bioprinting di estratti solubili di membrane basali. Le SBME sono caratterizzate da una sierologia unica e complessa che pone molte sfide nella loro manipolazione, richiedendo un controllo meticoloso durante la loro preparazione e limitandone fortemente l'uso come materiali puri. I sistemi standard di bioprinting pragmatici non riescono a controllare correttamente l'erogazione SBME, richiedendo spesso miscele di bio-inchiostro che introducono variabilità. Il sistema di bioprinting a controllo volumetrico può risolvere questi problemi, ma è limitato a soluzioni costanti. Rispetto alle tecniche, il nostro sistema di bioprinting a controllo volumetrico personalizzato offre una soluzione di costo locale per la biostampa di costrutti puri o diluiti utilizzando SBME con una buona fedeltà di forma.

[Istruttore] Per iniziare, carica il file di progettazione STL nel software di slicing. Posiziona il pezzo su una superficie piana e spostalo alle coordinate 65, 42,5, 0 millimetri negli assi X, Y e Z. Crea due copie facendo clic sul nome del file STL nell'elenco degli oggetti e selezionando Moltiplica selezionati. Spostali alle coordinate: 16, 42,5, 0 millimetri e -33, 42,5, 0 millimetri. Passare alle impostazioni di stampa nel menu stage. Nella sezione del muro, impostare il conteggio delle linee del muro su zero. Impostate lo spessore superiore e inferiore su zero nella sezione superiore e inferiore. Nel pannello di riempimento, impostare il motivo di riempimento su griglia; Distanza della linea di riempimento fino a cinque millimetri e direzioni della linea di riempimento fino a zero. Disabilitare la retrazione nella sezione di corsa, quindi disabilitare il raffreddamento della stampa nella sezione di raffreddamento. Nella sezione relativa all'adesione della piastra di stampa, selezionare none come tipo di adesione della piastra di stampa. Nella sezione della modalità speciale, selezionare un'opzione alla volta come sequenza di stampa. Fare clic sul pulsante di taglio per generare il codice G. Apri il file G-code utilizzando Blocco note. Rimuovere le righe M104 S200, M105 e M109 S200 nella riga 12 dopo la frase Generato con Cura_SteamEngine 4.9.0. Aggiungere G1 Z25 prima della riga, ; Nome del file della colonna MESH. STL. Dividi la riga successiva in due righe. Modificare il valore Z in Z25 in ogni riga presente dopo TIME_ELAPSED commento per l'ultima istruzione di livello di ogni pezzo. Posizionare il pallone contenente cellule di cancro alla prostata murino in commercio sotto una cappa di biosicurezza. Utilizzando una pipetta, rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pallone. Lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS e poi aspirarle. Aggiungere 500 microlitri di tripsina nel pallone. Porre il pallone in un'incubatrice per cinque minuti per facilitare il distacco delle cellule dalla piastra. Controllare le celle per la tripsinizzazione. Quindi, aggiungere 4,5 millilitri di terreno di coltura al pallone. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule staccate galleggino nel terreno. Aspirare il terreno e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Prelevare un'aliquota da 20 microlitri della sospensione e mescolarla con il blu di tripano. Pipettare 10 microlitri di questa miscela in una camera di conteggio delle cellule per contare le cellule vive. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 345 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet nell'estratto di membrana basale solubile a freddo, o matrice SBME alla densità cellulare desiderata. Utilizzando una siringa fredda, aspirare 800 microlitri della sospensione della matrice contenente cellule. Dopo aver rimosso eventuali bolle d'aria intrappolate dalla siringa, posizionare la siringa in una scatola sterile e incubare per 15 minuti per consentire la gelificazione. Dopo l'incubazione, inserire la siringa nella testina di stampa Bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia a contatto con il blocco di spinta. Fissare lo stantuffo e la siringa utilizzando il fermo del pistone della siringa. Utilizzare due viti e i rispettivi dadi per fissare. Utilizzare i dadi M4 nella parte inferiore dell'estrusore per regolare la pressione della molla e bloccare la siringa in posizione. Calibrare il sistema selezionando l'impostazione di casa automatica nel menu della bio-stampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi. Posizionare una piastra a sei pozzetti sul piano di stampa. Spostare l'estrusore utilizzando il comando di spostamento degli assi fino a quando la punta dell'ago tocca il fondo del pozzetto per definire manualmente Z zero. selezionare il file G-code dall'opzione di menu nella bio-stampante e iniziare a stampare per depositare una griglia quadrata a sei strati con un lato di 2,6 centimetri in ciascun pozzetto. Dopo la stampa, utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che il processo di stampa abbia esito positivo. Posizionare la piastra multipozzetto nell'incubatore per due minuti per consentire alla SBME di stabilizzarsi dopo l'estrusione. Infine, pipettare due millilitri di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Questa figura presenta la valutazione della stampabilità nei modelli a serpentina, concentrandosi sull'omogeneità delle fibre e sul rapporto di diffusione a velocità di avanzamento variabili. All'aumentare della velocità di avanzamento da E100 a E200, anche il rapporto di diffusione è aumentato, indicando una deposizione di fibre più ampia a portate più elevate. Quando la velocità di stampa è stata variata da cinque millimetri al secondo a 20 millimetri al secondo, il rapporto di diffusione è rimasto relativamente stabile in tutte le condizioni testate, suggerendo che la velocità di stampa ha avuto un impatto minimo sulla larghezza della fibra. Questa figura mostra la valutazione della stampabilità di griglie a strato singolo e multistrato. Nelle strutture a strato singolo, le variazioni nella dimensione dei pori hanno portato a notevoli differenze nell'uniformità della griglia. Durante la stampa di griglie multistrato, i costrutti hanno mantenuto in gran parte la loro fedeltà formale. Le strutture stampate significano che il diametro delle fibre era coerente con i modelli CAD e le costruzioni a strato singolo. Ciò dimostra che il processo di bioprinting mantiene l'affidabilità attraverso strutture multistrato e geometrie variabili. Questa figura valuta la vitalità cellulare nei costrutti biostampati in 3D rispetto ai campioni di controllo. La vitalità è rimasta al di sopra dell'80%, in modo simile ai campioni di controllo, indicando che il processo di stampa ha avuto un impatto minimo. Le immagini al microscopio con ingrandimento 10X e 20X non hanno mostrato differenze morfologiche significative, confermando una distribuzione cellulare e una morfologia simili in entrambi i gruppi.