Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Il nostro team studia i disturbi metabolici, cardiaci, muscolari del sonno e dell'invecchiamento utilizzando il modello di Drosophila. Questo documento di Jove descriveva in dettaglio il protocollo semplificato per l'elaborazione del tessuto cerebrale, tra cui decapitazione, fissazione, criosezione, colorazione e imaging. Il mio gruppo di ricerca è stato pioniere nello sviluppo del modello di Drosophila per studiare diverse malattie umane e l'invecchiamento.

Abbiamo anche studiato interventi come l'alimentazione a tempo limitato e l'esercizio fisico. Utilizziamo l'apprendimento automatico, l'approccio omico e molecolare per studiare fattori come il ritmo circadiano e la genetica per rivelare il loro impatto sull'integrità cellulare, sulla fisiologia e sul comportamento. Questo protocollo semplificato di ricerca sul cervello di Drosophila evita dissezioni complesse, richiede l'esecuzione con una sola mano ed elimina la necessità di una costosa microscopia confocale, aumentando l'accessibilità e riducendo la dipendenza dalle apparecchiature.

Per iniziare, procurati le mosche in fiale di invecchiamento, quindi apri la valvola sul tappetino di anidride carbonica e scarica rapidamente le mosche sul tappetino per evitare la fuga. Una volta che le mosche diventano per lo più incoscienti, posizionarle sotto il microscopio SZ61 spostando il tappetino sotto la lente dell'obiettivo. Regola l'ingrandimento e la messa a fuoco fino a quando le mosche non sono chiaramente visibili e comode da decapitare.

Usando le forbici a molla, posiziona le lame tra il torace e la testa della mosca e stringi con decisione per decapitare da cinque a 10 teste di mosca per gruppo sperimentale. Rimetti tutte le mosche usate nella loro fiala invecchiata. Usando un pennello, trasferisci delicatamente le teste di mosca decapitate in tubi da 1,5 millilitri etichettati posti sul ghiaccio.

Dopo aver rimosso i tubi dal ghiaccio, pipettare 100 microlitri di paraformaldeide al 4% e PBS in ogni tubo assicurandosi che tutte le teste delle mosche siano completamente sommerse. Se le teste aderiscono alle pareti del tubo, spingerle delicatamente verso il basso con una spazzola o picchiettare leggermente il tubo contro una superficie orizzontale per garantire un contatto corretto con la soluzione. Quindi incubare le provette per 15 minuti su un agitatore orbitale a una temperatura media.

Scartare la soluzione di paraformaldeide e sostituirla con PBS, assicurandosi che tutte le teste delle mosche siano sommerse. Dopo il lavaggio finale, trasferisci le teste delle mosche in una soluzione di saccarosio al 10% in PBS, assicurandoti che siano immerse nel tubo. Riempire uno stampo etichettato a circa il 50% della capacità con una temperatura di taglio ottimale o un composto OCT, consentendogli di diffondersi su tutti e quattro gli angoli dello stampo.

Usando un pennello, posizionare con cura le teste di mosca fisse raccolte sulla superficie del composto OCT all'interno dello stampo. Usando la punta della pinza, spingere delicatamente ciascuna testina sul fondo dello stampo, assicurandosi che gli occhi siano orientati verso il basso per un taglio attraverso il piano coronale. Allineare attentamente tutte le teste nelle dimensioni X, Y e Z per assicurarsi che tutte le sezioni contengano tutti i gruppi sperimentali contemporaneamente.

Dopo aver allineato correttamente le testine, posizionare con cura gli stampi direttamente in un congelatore impostato a meno 20 gradi Celsius per congelare. Una volta che lo stampo si è quasi congelato, riempire lo spazio rimanente con il composto OCT. Per la criosezione dello stampo, applicare una generosa quantità di composto OCT sulla parte superiore dello stampo per fissare la punta del mandrino allo stampo.

Posiziona la punta in piano sopra e lasciala congelare completamente all'interno del criostato, operazione che in genere richiede cinque minuti. Quindi rilasciare la punta e il blocco OCT dallo stampo. Posizionare il blocco nel mandrino, assicurandosi che venga mantenuto il corretto orientamento dall'alto verso il basso e serrare la chiave del mandrino finché il blocco non è saldamente in posizione.

Utilizzando le manopole di regolazione e i controlli della profondità del mandrino, allineare il blocco con la lama. Impostare la larghezza della sezione sul criostato a 20 micrometri e tagliare ogni fetta con un movimento lento e costante, consentendo al vetro anti-rollio di catturare ogni fetta. Quindi cattura le sezioni utilizzando diapositive calde toccando la diapositiva fino al bordo più vicino della sezione e lasciando che la sezione si sollevi sulla diapositiva.

Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, ma non più di un'ora. Prendi le teste di mosca di Drosophila criosezionate e usa una lama di rasoio per rimuovere qualsiasi residuo di composto OCT sui bordi del vetrino, lasciando spazio per un bordo idrofobo. Quindi usa un pennarello idrofobico per disegnare un bordo attorno a ogni vetrino e lascialo asciugare per cinque minuti.

Lavare tutti i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando il PBS pipettando delicatamente il vetrino. Dopo aver lavato i vetrini, pipettare sui vetrini il 3% di BSA nella soluzione bloccante salina tamponata Tris e incubare per 30 minuti a un'ora. Quindi scartare la soluzione bloccante e pipettare la soluzione di anticorpi primari sui vetrini.

Incubare l'anticorpo durante la notte a quattro gradi Celsius o per un'ora a temperatura ambiente utilizzando salviette per fazzoletti bagnate per evitare che si secchi. Eliminare la soluzione di anticorpi primari e lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando PBS. Quindi aggiungere la soluzione di anticorpi secondari ai vetrini e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo aver lavato i vetrini tre volte con PBS, lasciare solo una piccola quantità di PBS sul vetrino. Quindi, utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, aggiungere da tre a cinque gocce di terreno di montaggio indurente contenente DAPI in modo uniforme sul vetrino. Posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino assicurandosi che non si formino bolle d'aria durante il posizionamento.

Maneggiare con cura le diapositive appena montate e conservarle in piano fino a quando il supporto di montaggio non è completamente asciutto. Se è necessaria una conservazione a lungo termine, sigillare i bordi dei vetrini. Acquisisci le immagini dei vetrini il prima possibile per ridurre al minimo il decadimento fluorescente.

Durante l'acquisizione dell'immagine, concentrarsi su ogni soggetto unico nello stesso canale per garantire la coerenza tra tutti i gruppi sperimentali. Calibrare le esposizioni per ciascun canale per evitare la sovraesposizione in tutti i canali selezionati. Assicurarsi che le esposizioni selezionate rimangano costanti e siano appropriate per tutti i soggetti, in particolare tra diversi gruppi sperimentali.

L'espressione del tag anticorpale ApoE era chiaramente localizzata nelle regioni cerebrali dei campioni Elav+ ed Elav-ApoE4. L'accumulo di lipidi è stato indicato dalla colorazione rosso Nilo, che era visibile nelle regioni cerebrali in entrambi i genotipi.