L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

La nostra ricerca mira a comprendere il ruolo dei sottogruppi di neutrofili e come contribuiscono alla patogenesi di malattie infiammatorie come il lupus. In un senso più ampio, il nostro lavoro dimostra anche l'eterogeneità delle popolazioni di neutrofili nella biologia umana e come questa possa cambiare in base al variare degli stati fisiologici. Ricerche emergenti mostrano che le popolazioni di neutrofili nell'uomo sono eterogenee.

Tuttavia, i neutrofili continuano ad essere studiati come una singola popolazione a causa della difficoltà di isolare i sottotipi in modo affidabile senza attivazione e in quantità sufficiente. Il nostro protocollo fornisce un metodo per l'isolamento intatto e la caratterizzazione di base dei sottotipi di neutrofili, superando questi problemi. Ricerche recenti, anche se limitate, hanno dimostrato che i sottotipi di neutrofili, come i neutrofili a bassa densità, svolgono un ruolo in stati fisiologici alterati come la gravidanza e l'infiammazione, nonché in malattie come la tubercolosi, l'autoimmunità e il cancro.

Il nostro protocollo consentirà una ricerca riproducibile e solida sui contributi di queste cellule alla salute e alle malattie umane. Ora che disponiamo di un protocollo robusto e collaudato per separare i neutrofili a bassa densità dai neutrofili a densità normale, ci stiamo concentrando sulla risposta alle domande di base relative a come questi neutrofili a bassa densità si presentano in condizioni infiammatorie. Siamo particolarmente interessati a come questi siano diversi dai neutrofili a densità normale nel numero di cellule, nel fenotipo immunitario, nel metabolismo immunitario e altro ancora.

Per iniziare, etichettare quattro provette coniche da 50 millilitri per soluzioni di lavoro isotoniche di 100%81%70% e 55%Aggiungere 27 millilitri di mezzo di gradiente di densità alla prima provetta etichettata 100%Aggiungere 3 millilitri di PBS 10X. Quindi, misurare i volumi richiesti di soluzioni isotoniche funzionanti al 100% e 1X PBS per ogni concentrazione delle soluzioni di lavoro. Aggiungerlo ai rispettivi tubi conici.

Usa una pipetta Pasteur per mescolare accuratamente per omogeneità. Ora sovrapporre accuratamente 3 millilitri della soluzione isotonica di lavoro all'81% sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri. Quindi sovrapporre lentamente e delicatamente 3 millilitri della soluzione isotonica di lavoro al 70%, assicurandosi che gli strati non si mescolino.

Per preparare il tampone di separazione cellulare, combinare il 2% di siero fetale bovino, 1 millimole di EDTA e PBS per un volume totale di 500 millilitri. Pipettare per miscelare accuratamente per uniformità. Agitare accuratamente le perline magnetiche per 30 secondi per assicurarsi che siano completamente risospese prima dell'uso.

Per ogni donatore, aliquotare 4 millilitri di sangue intero in tre provette separate da 14 millilitri a fondo tondo. Pipettare 200 microlitri di cocktail di isolamento dei neutrofili e 200 microlitri di microsfere magnetiche in ogni provetta. Pipettare delicatamente la soluzione per risospendere la miscela prima dell'incubazione per consentire ai reagenti di legarsi alle cellule indesiderate.

Quindi, aggiungere il tampone di separazione cellulare a ciascuna provetta per portare il volume a 12 millilitri e mescolare bene. Posizionare le provette senza coperchio su un rack magnetico e incubarle. Utilizzare ora una pipetta sierologica per trasferire con cura la sospensione cellulare trasparente contenente neutrofili da ciascuna provetta in una nuova provetta pulita.

Quindi rimuovere il tubo originale dal magnete. Agitare nuovamente le perline magnetiche per 30 secondi. Aggiungere 200 microlitri di microsfere magnetiche alla sospensione cellulare appena trasferita prima della risospensione e dell'incubazione, come dimostrato in precedenza.

Riposizionare i tubi sul magnete senza coperchi. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, trasferire la sospensione cellulare trasparente contenente neutrofili isolati in una nuova provetta. Estrarre le sospensioni di neutrofili isolate ottenute dal sangue intero in un'unica provetta da 50 millilitri.

Rabboccare la provetta fino a un volume totale di 50 millilitri utilizzando il tampone di separazione cellulare. Centrifugare con il freno inserito, quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet di neutrofili in 1 millilitro di tampone di separazione cellulare. Dopo aver centrifugato nuovamente la sospensione, scartare il surnatante e risospendere il pellet di neutrofili in 3 millilitri del mezzo di gradiente di densità del 55%.

Sovrapporre lentamente i 3 millilitri di terreno a gradiente di densità al 55% contenente la sospensione cellulare sui tubi a gradiente di densità predefiniti, evitando di disturbare il gradiente. Centrifugare le provette a 720 G per 30 minuti senza utilizzare la pausa. Dopo la centrifugazione, maneggiare le provette con cura per evitare di disturbare gli strati.

Con una pipetta di trasferimento, isolare accuratamente gli strati separati contenenti neutrofili a bassa e normale densità e trasferirli in provette da 15 millilitri separate etichettate. Per lavare via qualsiasi mezzo di gradiente di densità residuo, aggiungere PBS a ciascun tubo da 15 millilitri fino al segno di 15 millilitri. Successivamente, centrifugare a 400 G per 5 minuti a temperatura ambiente con la pausa inserita.

Contare le cellule in ogni frazione su un emocitometro prima di ulteriori esperimenti. La stratificazione dei neutrofili totali sul mezzo del gradiente di densità ha portato alla formazione di due bande distinte. Con i neutrofili a bassa densità che formano una banda superiore e i neutrofili a densità normale che formano una banda inferiore.

Il sovraccarico del mezzo del gradiente di densità con neutrofili superiori a 5-6 milioni di cellule per millilitro ha causato l'apparizione diffusa delle bande, aumentando il rischio di miscelazione dei sottotipi. La purezza media dell'isolamento è stata del 93,8% per i neutrofili a bassa densità e del 96,3% per i neutrofili a densità normale con contaminazione minima da altri tipi di cellule.