Name: Regolazione fine dellorientamento di Caenorhabditis elegans su cuscinetti agar canalizzati per la neurorigenerazione dellimaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Impara a creare cuscinetti agar canalizzati con stampi PDMS per orientare Caenorhabditis elegans e migliorare l'imaging nella ricerca sulla neurorigenerazione. Questo metodo ottimizza la visualizzazione delle strutture neuronali.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fabbricazione di cuscinetti in agar canalizzati utilizzando stampi PDMS per il controllo dell'orientamento degli animali

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>125 mL Erlenmeyer pallone</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM o 12 pollici di riproduzione lunga (LP) disco in vinile.</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Profondità del singolo canale: 50 &micro; m, larghezza: 200 &micro; m</td></tr><tr><td>30 mL siringa di plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% platino, 10% filo di iridio</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td><td>utilizzato per creare</td></tr><tr><td>un foglio di alluminio</td> platino.<td>Amazon</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>lastra di vetro</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>7 in x 5 in lastra di vetro prelevata dal telaio&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetta in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>utilizzata per creare</td></tr><tr><td>la piastra calda per platino&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>SP88857104</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>vetrini per microscopio&nbsp;</td><td>Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td>agar di grado di biologia molecolare</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr> vetro <tr><td>di copertura quadrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (Fast Cure) Kit incapsulante in elastomero siliconico, trasparente, otticamente trasparente, miscela 10:1, 500 gm/ml (0,5 kg), più veloce di Sylgard 184 e simili&nbsp;</td><td>Essiccatore sottovuoto MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>piatto di pesata&nbsp;</td><td>Fisher Scientifico</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

regolazione fine dell'orientamento di caenorhabditis elegans su cuscinetti agar canalizzati per la neurorigenerazione dell'imaging

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Fabbricazione di stampi PDMS Il ciclo della pressione del vuoto durante la fabbricazione dello stampo fora e rimuove le bolle d'aria dal PDMS non polimerizzato, garantendo uno stampo privo di bolle. Come mostrato nella Figura 3D , le bolle salgono in superficie e si perforano. Gli stampi senza bolle possono produrre canali puliti.
Solidificazione dello stampo PDMS Quando si posiziona la lastra di vetro sul disco in vinile, evitare di creare intercapedini d'aria. Questi spazi vuoti possono portare a spessori irregolari o difetti superficiali. Le bolle, se presenti, possono essere rilevate visivamente. Premendo la lastra di vetro da un lato all'altro si sposta l'aria, riducendo al minimo la formazione di bolle e garantendo uno spessore uniforme dello stampo mostrato nella Figura 4A.
Utilizzo di cuscinetti di agar canalizzati per l'orientamento preciso di C. elegans I cuscinetti di agar canalizzati consentono un orientamento preciso di C. elegans. Impostiamo l'orientamento dell'animale facendo rotolare leggermente l'animale con un plettro di platino, verificando l'orientamento utilizzando punti di riferimento, come la vulva o l'intestino a forma di S (Figura 5A, C). Confermiamo l'orientamento sotto un microscopio da dissezione fluorescente prima di trasferire gli animali su un microscopio invertito mostrato nella Figura 5B, D.
Valutazione della rigenerazione delle fibre neuronali con cuscinetti di agar canalizzati I cuscinetti di agar canalizzati migliorano la qualità dell'imaging della rigenerazione neuronale orientando in modo ottimale l'animale. Il posizionamento delle fibre di neuroni rigenerati più vicino alla lente dell'obiettivo riduce la dispersione e l'assorbimento della luce, migliorando la nitidezza dell'immagine. Le figure 5E, F mostrano che posizionare il sito di rigenerazione più vicino all'obiettivo migliora la qualità dell'imaging, facilitando un'analisi più accurata della ricrescita neuronale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg"> 
Figura 1: Caenorhabditis elegans su cuscinetti piatti e canalizzati. (A) Animale su piattaforma di agar piatta con orientamento DV; La vulva affronta il vetrino coprioggetti. (B) L'introduzione del vetrino coprioggetti spinge la vulva di lato, costringendo l'animale all'orientamento laterale. (C) Animale su un pad di agar canalizzato con orientamento DV. (D) Resti di animali in orientamento DV dopo l'introduzione del vetrino coprioggetti. (E) Immagine in campo chiaro del mutante roller su un pad di agar canalizzato con orientamento DV. (F) Immagine in campo chiaro con vetrino coprioggetti, lo stesso animale di E rimane in orientamento DV. Abbreviazioni: DV = dorso-ventrale; lat = laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg"> 
Figura 2: Materiali e attrezzature per la fabbricazione di PDMS. (A) Kit di elastomeri siliconici SYLCAP 284-F. (b) Scala. (C) Siringa di plastica. (D) Essiccatore a vuoto. (E) Piastra riscaldante. (F) Disco in vinile da 12 pollici a riproduzione lunga, smontabile secondo necessità. (G) Lastra di vetro. Abbreviazione: PDMS = polidimetilsilossano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg"> 
Figura 3: Miscelazione e aspirazione di PDMS non polimerizzati. (A) Mescolare la base e l'agente indurente nella teglia. (B) Posizionare il vassoio in una camera a vuoto. (C) Passare l'aspirapolvere tre volte per consentire alle bolle di affiorare. (D) Dopo un'ora, la maggior parte delle bolle è scoppiata. Si noti una migliore trasmissione tramite PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg"> 
Figura 4: Introduzione di una lastra di vetro al PDMS non polimerizzato senza bolle. (A) Introduzione di una lastra di vetro su disco in vinile senza bolle. (B) Stampo PDMS solidificato rimosso dal disco, con canali di dettaglio inseriti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg"> 
Figura 5: Immagini in campo chiaro e a fluorescenza di C. elegans montate su agar canalizzato. (A) Immagine in campo chiaro di un animale in orientamento DV bilaterale. Punto di riferimento anatomico per l'orientamento DV: intestino a spirale a forma di S (tessuto più scuro indicato da una freccia) che attraversa la linea mediana ~60% della distanza tra naso e coda. (B) Immagine a fluorescenza di neuroni in orientamento DV, stesso animale di A. (C) Immagine in campo chiaro di un animale in orientamento lat. Punto di riferimento anatomico per l'orientamento del ltelletto: lato rivolto verso la vulva. (D) Immagine a fluorescenza di neuroni in orientamento lat, stesso animale di C. (E) Orientamento con rigenerazione (freccia) nel lato più profondo (lontano) di un animale. (F) Orientamento con rigenerazione in animali laterali meno profondi più vicini all'obiettivo; Rigenerazione più chiara (freccia). Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: DV = dorso-ventrale; lat = laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Regolazione fine dell'orientamento di Caenorhabditis elegans su cuscinetti agar canalizzati per la neurorigenerazione dell'imaging

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

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