Protocollo di iniezione diretta del nervo vago per i ratti

Conduciamo studi preclinici sulla terapia genica sostitutiva. Utilizziamo animali da laboratorio per stabilire il metodo ottimale di somministrazione dei farmaci per affrontare i problemi del sistema nervoso autonomo e periferico. La terapia sostitutiva genica basata su vettori è una delle tecnologie emergenti nella terapia genica. L'applicazione del vettore virale associato ad adino è una delle potenziali opzioni disponibili ora. AAV9 è stato ampiamente utilizzato nella ricerca sulla terapia genica per fornire il gene di interesse nel sistema nervoso centrale e periferico. I ricercatori non hanno abbastanza opzioni disponibili per somministrare agenti farmacologici direttamente nel sistema nervoso periferico. Ci sono situazioni che coinvolgono disturbi neurologici causati dal sistema nervoso periferico o autonomo. Tuttavia, manca un metodo efficace di somministrazione di farmaci per affrontare queste situazioni.

Questo metodo dimostra un modo per somministrare gli agenti farmacologici direttamente nei nervi vago per affrontare il problema del sistema nervoso autonomo negli studi preclinici sui ratti. Inoltre, questo metodo può essere esportato per somministrare farmaci attraverso altri nervi periferici con le modifiche necessarie in altre specie. Il laboratorio grigio continuerà la ricerca preclinica sulla terapia genica mediata da AV utilizzando sia roditori che animali di grandi dimensioni. Inoltre, ci siamo concentrati sullo sviluppo di nuovi metodi applicabili per spianare la strategia della terapia di sostituzione genica.

[Narratore] Per iniziare, collegare una siringa di vetro da 100 microlitri con lo stantuffo rimosso a un ago da 27 gauge. Collegare un'estremità di circa 45 centimetri di tubo in polietilene sterilizzato all'ago da 27 gauge, quindi inserire una siringa di plastica da tre millilitri con un ago da 27 gauge e caricare la siringa con circa 0,5 millilitri di soluzione fisiologica normale allo 0,9%. Utilizzare la soluzione fisiologica normale allo 0,9% per riempire il tubo di polietilene dall'estremità aperta, assicurandosi che il tubo e il cilindro della siringa di vetro siano riempiti fino a quando la soluzione salina non trabocca. Una volta fatto, rimuovere e gettare la siringa da tre millilitri e il relativo ago. Ora inserisci lo stantuffo nel cilindro della siringa di vetro, spingilo leggermente in avanti fino al centro del cilindro, quindi posiziona la siringa di vetro nella pompa a siringa. Utilizzare la pompa a siringa per tirare leggermente indietro lo stantuffo, creando uno spazio d'aria di circa 1,5 centimetri all'estremità aperta del tubo. Pipettare almeno cinque microlitri di colorante e miscela di farmaci candidati utilizzando una micropipetta da 10 microlitri su un pezzo di parafilm sterilizzato. Estrarre la miscela di farmaco candidato nel tubo con l'aiuto della pompa a siringa e contrassegnare il livello della miscela iniettabile con un pennarello. Montare un ago calibro 35 sul tubo e fissarlo su una superficie pulita nella fase chirurgica con del nastro adesivo, assicurandosi che rimanga fissato, sterilizzato e non tocchi nient'altro. Avviare la pompa a siringa per 10-15 secondi fino a quando la soluzione iniettabile inizia a fuoriuscire dalla punta dell'ago. Trasferire il ratto anestetizzato su un tavolo attrezzato per la depilazione e la preparazione del sito. Applicare un unguento lacrimante artificiale in entrambi gli occhi del ratto per prevenire un'eccessiva secchezza. Somministrare analgesici secondo il protocollo istituzionale approvato sugli animali per controllare il dolore quando il ratto riprende conoscenza. Rasare il lato ventrale del collo in corrispondenza della regione cervicale ed estenderlo fino a circa due centimetri perpendicolarmente dalla linea mediana su entrambi i lati dal mento allo sterno. Sterilizzare l'area rasata tre volte con alcol etilico al 70% e betadina al 10%, strofinando verso l'esterno secondo uno schema circolare. Trasferire il ratto allo stadio chirurgico in posizione supina sotto il microscopio da dissezione. Assicurarsi che il termoforo sotto il ratto sia temperato in modo appropriato e regolare i microscopi focalizzati per visualizzare la regione cervicale per l'intervento chirurgico. Aggancia i ratti o i denti della mascella con una sutura non assorbibile. Fissare l'estremità aperta della sutura all'interno del cono del naso per mantenere le narici all'interno del cono del naso durante l'anestesia. Posiziona il ratto in modo che la sua testa si trovi sul lato sinistro del chirurgo destrorso. Posiziona un cuscino di garza sterilizzato sotto il collo per allinearlo e raddrizza la regione cervicale. Coprire il corpo del ratto con un telo sterilizzato lasciando scoperta l'area chirurgica. Fissare quattro perni divaricatori con fissatori magnetici ai quattro angoli del tavolino chirurgico. Ora, iniettare anestetici locali epidermici sulla linea mediana della regione cervicale dove verrà praticata l'incisione. Usa una lama di bisturi per praticare un'incisione cutanea longitudinale di due centimetri sulla linea mediana tra il mento e lo sterno nella regione cervicale ventrale. Quindi, con punte di cotone sterilizzate, lo smussato separa i bordi della pelle tagliata. Utilizzando le punte del divaricatore, ritrarre i bordi separati della pelle in direzioni opposte. Separare la fascia usando punte di cotone per andare più in profondità e spingere lateralmente le ghiandole salivari. Ora, separa i muscoli mastoidei dello sterno con punte di cotone e ritraili lateralmente con i perni divaricatori. Continuare a separare il tessuto sul lato sinistro della trachea fino a quando la guaina carotidea è visibile. Usa una pinza fine per creare un piccolo foro nella guaina carotidea senza danneggiare l'arteria carotide e separa accuratamente il nervo vago sinistro dall'arteria carotide comune. Una volta che il nervo è stato separato dall'arteria usando una pinza, utilizzare un ago curvo calibro 25 montato su una siringa da un millilitro per agganciare e tenere il nervo con la mano non dominante. Tenere l'ago caricato con la miscela di colorante farmaco candidato con la mano dominante. Per facilitare una puntura liscia, mantieni il nervo dritto tirandolo delicatamente con il gancio calibro 25. inserire l'ago nel nervo e farlo avanzare in avanti di oltre 0,5 centimetri mantenendo l'ago parallelo al nervo vago. Tirare leggermente indietro in modo che rimangano circa 0,4-0,5 centimetri dell'ago all'interno del nervo. Limita il numero di punture nervose con un singolo ago a non più di tre volte. Dopo aver confermato l'inserimento dell'ago, mantenere la sua posizione senza movimento e accendere la pompa a siringa. Monitorare l'infusione per assicurarsi che rimanga all'interno del nervo e scorra senza intoppi. Utilizzare il punto contrassegnato sul tubo di infusione per tracciare il movimento della miscela di colorante per farmaci. Osserva come il nervo inizia a sviluppare il colore del colorante. Rimuovere l'ago curvo calibro 25 e, utilizzando punte di cotone sterile, riportare delicatamente i fazzoletti nella loro posizione originale. Quindi rimuovere le punte del divaricatore. Chiudere la ferita con una sutura riassorbibile o non assorbibile e, se necessario, applicare una piccola quantità di colla per tessuti tra i punti per assicurarsi che la ferita si chiuda perfettamente.