Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

La nostra ricerca si concentra sul ruolo dell'immunometabolismo durante l'infarto del miocardio. Vogliamo capire come i cambiamenti nel metabolismo delle cellule immunitarie regolano il loro fenotipo durante le lesioni cardiache e l'infiammazione.

Combiniamo gli approcci genetici in vivo con l'estrazione cellulare di precisione, la fenotipizzazione cellulare, la fenotipizzazione metabolica, la trascrittomica e la metabolomica per comprendere meglio l'impatto del metabolismo dei macrofagi sul rimodellamento cardiaco.

Questo protocollo ci permette di capire come cambia il metabolismo dei macrofagi dopo l'infarto miocardico, in diverse condizioni patologiche come l'obesità o il diabete, e come diverse terapie influenzano il metabolismo dei macrofagi.

Questa tecnica consente un'analisi rapida dei macrofagi vivi appena estratti, evitando così la coltura a lungo termine. Consente inoltre la valutazione simultanea di altri cambiamenti fenotipici nelle stesse cellule.

Questo protocollo consentirà a noi e ad altri di comprendere ulteriormente il metabolismo dei macrofagi in diversi stati infiammatori o autoimmuni. Potrebbe anche essere modificato per studiare altri sottotipi immunitari.

[Narratore] Per iniziare, prendi le ossa delle gambe dal topo sperimentale e taglia con cura entrambe le estremità dell'osso. Utilizzando una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 27, sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 15 millilitri contenente tampone PEB. Centrifugare la sospensione a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Generare una sospensione a singola cellula e lisare i globuli rossi. Quindi aggiungere il tampone PEB, seguito dal reagente bloccante il recettore Fc e dal cocktail di anticorpi biotina dei monociti a cinque volte 10 alla potenza di sette cellule totali. Incubare la miscela al buio a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Lavare le celle con 10 millilitri di tampone PEB e centrifugare la sospensione a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, raccogli il pellet cellulare e ririsolvilo in 500 microlitri di tampone PEB e 100 microlitri di microsfere anti-biotina. Incubare la miscela al buio a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Ora, prepara una colonna magnetica su un supporto con un millilitro di tampone PEB. Applicare immediatamente la sospensione cellulare alla colonna e raccogliere il flusso attraverso i monociti in una provetta da 15 millilitri. Dopo aver lavato la colonna due volte con un millilitro di tampone PEP, contare i monociti nel flusso utilizzando un emocitometro. Per preparare i monociti al passaggio successivo, centrifugarli a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per l'analisi del flusso, risospendere il pellet di cella in un millilitro di RPMI con FBS allo 0,1%. Conservare le cellule rimanenti in PEB freddo per la citometria a flusso e procedere con la colorazione. Un giorno prima del test, rimuovere la cartuccia del sensore dalla confezione. Staccare la piastra verde del sensore dai pozzetti e pipettare 200 microlitri di liquido calibrante in ciascun pozzetto. Riposizionare la piastra del sensore sulla piastra della cartuccia in modo che i sensori siano immersi nel liquido di calibrazione. Posizionare la cartuccia in un incubatore umidificato senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi piastrate le cellule insieme a 200 microlitri di terreno in una piastra di coltura a 96 pozzetti per almeno un'ora. Preparare il terreno di flusso metabolico per il saggio. Utilizzare RPMI basale o DMEM senza glucosio, glutammina o piruvato e integrare i terreni in base al test specifico. Sostituire con cura i vecchi terreni nei pozzetti con i terreni basali appena preparati e controllare le cellule al microscopio per confermarne l'integrità. Posizionare la piastra cellulare in un incubatore umidificato senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius. A questo punto, recuperare la piastra di flusso della cartuccia del sensore idratato dall'incubatore e preparare i composti di prova per i test di glicolisi o stress mitocondriale. Caricare volumi appropriati di composti di prova nelle porte della piastra di flusso. Ora apri il software e seleziona Test da sforzo mitocondriale. Seleziona i pozzetti da utilizzare, assicurandoti che almeno un pozzetto sia vuoto per le misurazioni di fondo. Per eseguire il programma, caricare la piastra di flusso senza coperchio per la calibrazione, che richiede circa 20 minuti. Dopo la calibrazione, rimuovere la parte inferiore della piastra di flusso e posizionare la piastra della cella nel supporto. Premere Esegui per avviare il test, che richiederà circa 2,5 ore. Analizza i risultati utilizzando il software di flusso metabolico o altri strumenti analitici. Il midollo osseo di due tibie e due femori ha prodotto una buona quantità di monociti. La citometria a flusso ha illustrato l'eterogeneità dei macrofagi cardiaci e splenici per Ly6C, mentre i monociti del midollo osseo sono risultati altamente positivi per Ly6C. I cambiamenti nel tasso di acidificazione extracellulare e nel tasso di consumo di ossigeno sono stati visualizzati come innesti di linea. Il digiuno nei topi ha portato a una diminuzione della glicolisi e ad un aumento dell'OCR mediante il rapporto ECAR nei monociti del midollo osseo, come osservato sia nei test da sforzo mitocondriali che in quelli di glicolisi.