Metodo nuovo ed efficiente per la colorazione a fluorescenza cardiaca di Drosophila con criosezione

Il mio laboratorio di ricerca utilizza il modello della drosofila per studiare l'invecchiamento e il disordine metabolico, esplorando l'alimentazione e l'esercizio fisico a tempo limitato come intervento per le malattie metaboliche, del muscolo cardiaco, del sonno e di altre malattie dell'invecchiamento. L'apprendimento automatico e l'omia con la strategia genetica e nutrizionale fisiologica stanno semplificando il test della drosofila utilizzando dispositivi stampati in 3D e approcci di apprendimento automatico. L'immunoistochimica fluorescente dei cuori di drosofila consente il rilevamento di più proteine in tutti i genotipi e le età, ma deve affrontare sfide come dissezioni complesse, conservazione dei tessuti e imaging ad alta risoluzione di uno specifico pattern di espressione proteica.

Questo protocollo migliora la conservazione dei tessuti, la penetrazione degli anticorpi e la risoluzione dell'imaging, consentendo una migliore visualizzazione dei marcatori proteici cardiaci. Affronta sfide come la dissezione complessa, il danno tissutale e la risoluzione limitata nel tradizionale metodo di montaggio dell'intero cuore. Questo protocollo migliora l'accessibilità alla ricerca sul cuore della drosofila eliminando la dissezione complessa, consentendo l'esecuzione con una sola mano ed evitando la costosa microscopia confocale, rendendo più fattibile l'imaging ad alta risoluzione.

Per iniziare, anestetizzare da 5 a 10 mosche utilizzando un tappetino antimosche ad anidride carbonica. Posizionare le mosche in vista sotto il microscopio con un ingrandimento da 1X a 2X. Usando le forbici a molla, decapita le mosche, taglia le ali e rimuovi le zampe.

Mantenere il torace e l'addome uniti, indicato come il corpo. Usando un pennello, posizionare delicatamente i corpi in tubi da 1,5 millilitri etichettati su ghiaccio fino a quando tutti i gruppi sperimentali non sono stati raccolti. Dopo aver rimosso le provette dal ghiaccio, aggiungere 100 microlitri di acido etilenglicole tetraacetico da 10 millimolari a pH 8 in ciascuna provetta.

Assicurarsi che tutti i corpi siano immersi e posizionare i tubi su un agitatore orbitale per 10 minuti. Quindi, rimuovere ed eliminare la soluzione di acido etilenglicole tetraacetico dalle provette. Pipettare 100 microlitri di PBS in ogni provetta per lavare il fazzoletto per 10 minuti.

Posizionare i tubi sull'agitatore orbitale durante il processo di lavaggio. Dopo aver scartato il PBS, pipettare 100 microlitri di paraformaldeide al 4% in soluzione di PBS in ciascuna provetta. Posizionare le provette su un agitatore orbitale a 100 unità per 15 minuti, assicurandosi che i tessuti rimangano a contatto con la soluzione.

Quindi, scartare la soluzione di paraformaldeide. Una volta completato il lavaggio finale, trasferire i corpi in una soluzione di saccarosio al 10% in PBS. Assicurarsi che i corpi siano a contatto con la soluzione all'interno del tubo.

Recupera il ghiaccio secco dal deposito e seleziona alcuni pezzi da posizionare in un piccolo vassoio di metallo o plastica. Scegli una teglia con dimensioni che permettano di inserire lo stampo e posizionala direttamente sopra un unico pezzo di ghiaccio secco grande e piatto. Riempire uno stampo etichettato al 50% con una temperatura di taglio ottimale o un composto OCT, versando lentamente per ridurre al minimo le bolle.

Con un pennello, posizionare con cura i corpi di drosofila sezionati e fissati sulla superficie del composto OCT all'interno dello stampo. Usando una pinza, spingi ogni corpo verso il fondo dello stampo con la parete dorsale del torace e dell'addome generalmente allineati lungo il fondo. Regolare i corpi in modo che l'addome sia piatto lungo il fondo dello stampo.

Allinea tutti i corpi nelle dimensioni X, Y e Z per assicurarti che ogni sezione includa tutti i soggetti contemporaneamente. Correggere la curvatura dell'addome, soprattutto nei maschi, per appiattirlo il più possibile senza forare o schiacciare i corpi. Una volta che tutti i soggetti sono a posto, posiziona lo stampo in modo che il fondo si trovi direttamente sopra un pezzo di ghiaccio secco.

Assicurarsi che il composto OCT inizi a congelarsi al contatto e continuare fino a quando tutti i soggetti non sono completamente racchiusi nello stampo. Dopo il congelamento, trasferire lo stampo in un congelatore impostato a meno 20 gradi Celsius per consentire il congelamento completo dappertutto. Una volta completamente congelato, riempire la parte rimanente dello stampo con il composto OCT.

Per attaccare una punta per mandrino allo stampo, applicare una generosa quantità di composto OCT sul blocco. Premere la punta piatta sul composto e lasciarla congelare completamente nel criostato, in genere entro cinque minuti. Quindi rilasciare la punta del mandrino e il blocco OCT dallo stampo.

Posizionare la punta nel mandrino, assicurandosi che il blocco rimanga orientato correttamente dall'alto verso il basso e serrare la chiave del mandrino per fissare la punta. Ora, utilizzando le manopole di regolazione e i controlli della profondità del mandrino, allineare il blocco con la lama e impostare la larghezza della sezione a 20 micrometri o inferiore. Taglia ogni fetta dal blocco con un movimento lento ma costante, consentendo al vetro antirollio di catturare ogni fetta mentre viene tagliata.

Raccogli le sezioni usando diapositive riscaldate. Con una lama di rasoio, rimuovere il composto OCT in eccesso che circonda le sezioni. Delineare il bordo di ogni vetrino utilizzando un pennarello idrofobico per mantenere le soluzioni di lavaggio e colorazione confinate nel tessuto.

Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno senza toccare il fazzoletto. Dopo aver scartato il lavaggio finale, pipettare la soluzione colorante fluorescente sui fazzoletti e incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio. Quindi, scartare la macchia fluorescente e lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS.

Successivamente, scartare il lavaggio PBS finale, lasciando una piccola quantità di soluzione sul vetrino. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, pipettare da tre a cinque gocce di terreno di montaggio sul vetrino, evitando l'applicazione diretta sul tessuto. Usando una pinza, posizionare il vetrino coprioggetti su un bordo e abbassare gradualmente l'altro lato fino a quando non è a filo con il vetrino.

Sigilla le diapositive con smalto per unghie senza neon o glitter. Se il supporto di montaggio non si indurisce a seconda della macchia fluorescente, eseguire immediatamente l'imaging o conservare le diapositive per un secondo momento. Prima dell'imaging, ispezionare i vetrini per verificarne la pulizia e pulirli delicatamente con un panno con una soluzione acquosa al 70% di etanolo.

Analizza i soggetti fluorescenti più luminosi all'interno dell'esperimento per selezionare i tempi di esposizione appropriati per ciascun canale di fluorescenza. Esamina ogni gruppo sperimentale in una visualizzazione in tempo reale per tutti i canali per confermare le impostazioni di esposizione corrette. Per coerenza, metti a fuoco ogni soggetto utilizzando lo stesso canale di fluorescenza e acquisisci immagini per tutti i soggetti.

Dopo l'imaging, conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius per una futura acquisizione dell'immagine. Il metodo di imaging a fluorescenza ha preservato le caratteristiche chiave del cuore di Drosophila, come gli osti, la valvola, le fibre longitudinali e le fibre circonferenziali. L'intera struttura del tubo cardiaco e le strutture minori dettagliate sono state catturate a diversi ingrandimenti, con ingrandimenti da 10X per l'intera struttura e ingrandimenti da 40X a 60X che mostrano dettagli più fini, come le fibre contrattili circonferenziali e le fibre stabilizzanti longitudinali.

Micrografie a fluorescenza rappresentative hanno dimostrato strutture cardiache conservate in w1118 drosophila con nuclei colorati con DAPI, lipidi colorati di verde e miofibrille contenenti actina colorate di rosso con falloidina. La colorazione falloidina ha evidenziato efficacemente le fibre longitudinali e circonferenziali, dimostrando la struttura preservata del filamento di actina nonostante le sollecitazioni di congelamento e sezionamento. La colorazione delle macchie lipidiche ha rivelato un accumulo di grasso localizzato vicino al tubo cardiaco.