Sviluppo e valutazione di modelli di infezione intracellulare per Staphylococcus aureus

La nostra ricerca si concentra sulle infezioni da stafilococco aureo con l'obiettivo di stabilire un modello di infezione intercellulare. Questo modello fornirà preziose informazioni sul meccanismo alla base delle infezioni intercellulari e contribuirà allo sviluppo di un'età rigorosa per la loro prevenzione e trattamento. L'ultimo progresso nell'infezione intracellulare da stafilococco aureo è quello di studiare il meccanismo di infezione per regolare la sopravvivenza e la diffusione dei batteri all'interno della cellula e aggiungerà per ottimizzare il farmaco e la modifica strutturale per migliorare l'effetto terapeutico.

Questi campi di ricerca utilizzano la coltura cellulare, la tecnologia di sequenziamento cellulare emergente, l'ossitermiche ad alto combustibile, la tecnologia di editing genetico e altre tecnologie correlate per studiare l'infezione batterica nelle cellule. A differenza dei modelli di infezione tradizionali, abbiamo affinato le condizioni sperimentali specifiche per le infezioni intracellulari. Dopo aver infettato individualmente le cellule con stafilococco aureo, le cellule infettate dai batteri vengono quindi inoculate nei topi per stabilire infezioni intracellulari.

Questo approccio migliora l'efficienza riducendo al minimo l'interferenza dei batteri liberi, garantendo una ritenzione più accurata del processo di infezione intracellulare. Il nostro metodo si concentrerà sullo sviluppo di farmaci anticorpali e avanzerà per prevenire e trattare le infezioni batteriche in futuro. Per preparare un brodo di amido al 6%, aggiungere l'estratto di manzo in polvere, il triptone e il cloruro di sodio in un contenitore di vetro in successione nel rapporto di massa da 3 a 10 a 5.

Aggiungere 100 millilitri di acqua distillata doppia e mescolare per sciogliere i componenti. Scaldare la soluzione nel microonde. Quindi, aggiungere l'amido solubile in un rapporto di massa di 6 e mescolare il composto fino a completo scioglimento.

Sterilizzare in autoclave il brodo a 121 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta sterilizzato, conservare il brodo a quattro gradi Celsius fino a formare una pasta. Per raccogliere i macrofagi peritoneali del topo, usando la mano sinistra, afferrare il collo del topo e controllarne la coda.

Quindi, capovolgi il mouse in modo che la sua testa sia posizionata verso il basso e il suo addome sia rivolto verso l'alto. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di tre millilitri di brodo di amido al 6% nel topo. Dopo 72 ore dall'iniezione, sacrificare il topo anestetizzato e disinfettarlo con alcol etilico al 75%.

Usando le forbici oftalmiche, taglia l'addome del topo per esporre completamente il peritoneo. Iniettare 10 millilitri di DMEM nella cavità addominale attraverso l'iniezione intraperitoneale. Strofinare delicatamente l'addome per un minuto per lavare la carie.

Quindi, utilizzare una siringa per raccogliere il liquido lavato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare il liquido di lavaggio a 300 g per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS, penicillina e streptomicina.

Prendi 10 microlitri di sospensione cellulare e aggiungilo al contatore di cellule per contare le cellule. Diluire le cellule a una concentrazione di 2 volte 10 alla potenza di 6 cellule per millilitro con DMEM FBS. Piastra un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto su una piastra a sei pozzetti.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per quattro ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante. Lavare le cellule due volte con PBS sterile e colturarle per una notte con un millilitro di DMEM per pozzetto nelle stesse condizioni.

Incubare i macrofagi peritoneali con staphylococcus aureus MRSA-252 per due ore. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungere un millilitro per pozzetto di terreno DMEM completo contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS. Utilizzando un raschietto cellulare, raccogliere i macrofagi peritoneali in provette da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare i campioni a 1000 G per cinque minuti.

Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di lisozima ai macrofagi infettati con MRSA-252 intracellulare e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, risospenderle in un millilitro di PBS. Quindi, prelevare circa 20 microlitri di aliquota e aggiungere lo 0,1% di Triton X-100 per cinque minuti per lisare le cellule.

Eseguire diluizioni seriali della sospensione cellulare lisata con PBS e farle cadere su una piastra a coclea di soia triptica. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, contare le colonie batteriche per calcolare i batteri MRSA-252 intracellulari nei macrofagi peritoneali.

Posizionare il mouse sotto una lampada per fisioterapia a infrarossi fino a quando la vena caudale non si dilata. Dividi casualmente i topi in quattro gruppi. Iniettare per via endovenosa 3 volte 10 alla potenza di 6 CFU Planktonic MRSA-252 nella vena caudale del topo.

Trascorse le 24 ore, sacrificare il topo anestetizzato e disinfettarlo accuratamente con alcool etilico al 75%. Usa le pinzette con una mano per sollevare la pelle addominale e con l'altra mano taglia la pelle usando le forbici oftalmiche. Individua i reni nella cavità addominale e spogliali completamente con cura.

Trasferire i reni in un tubo di macinazione contenente un millilitro di PBS e macinarli fino a quando non rimane tessuto solido. Versare il fazzoletto omogeneizzato nella provetta Eppendorf. Eseguire diluizioni seriali dell'omogeneizzato tissutale utilizzando PBS.

Individua ogni diluizione su piastre separate per coclea di soia a trittico e incubale per una notte a 37 gradi Celsius. Conta le colonie batteriche il giorno successivo e analizza i dati. I modelli di infezione intracellulare di S.aureus sono stati stabiliti con successo in condizioni di fagocitosi ottimizzate e hanno esteso il trattamento antibiotico con alcuni batteri sopravvissuti all'interno dei macrofagi.

I macrofagi infettati con S. aureus resistente alla meticillina hanno trattenuto i batteri intracellulari dopo due ore di trattamento antibiotico, quando il surnatante non conteneva più batteri. In vivo, i saggi di colonizzazione batterica nei topi hanno mostrato che la vancomicina ha eliminato S.aureus extracellulare, ma non è riuscita a eliminare i batteri intracellulari.