Analisi dell'espressione di oncogeni con alterazioni del pH in una linea cellulare duttale pancreatica
11 aprile 2025
Questo studio descrive un protocollo per esplorare gli effetti dell'alterazione del pH sull'espressione dell'oncogene attraverso l'analisi RNA-seq di una linea cellulare duttale pancreatica.
Negli ospedali AIG, studiamo come la diminuzione delle secrezioni duttali pancreatiche e la diminuzione del pH influenzino l'espressione genica nelle cellule duttali pancreatiche, concentrandoci in particolare sugli oncogeni, esplorando la possibilità di adattamento cellulare ai microambienti acidi. La sfida qui è l'eterogeneità dei tumori del pancreas, che complica il trattamento e gli approcci sperimentali. Quindi abbiamo condotto l'analisi RNAC delle cellule duttali pancreatiche in condizioni di pH ridotto e abbiamo scoperto che c'è un aumento dell'espressione di tre oncogeni che evidenziano i potenziali legami tra l'ambiente acido e l'espressione dell'oncogene nelle cellule duttali pancreatiche.
Il nostro studio ha fatto luce sull'espressione dell'oncogene in condizioni di pH ridotto e questo sistema può far progredire la nostra ricerca nello studio dell'adenocarcinoma duttale pancreatico in condizioni di infiammazione. Quindi lo scopo futuro di questo studio è quello di valutare il ruolo dell'aumento dell'espressione oncogenica nell'inizio dei tumori in condizioni infiammatorie, come nella pancreatite cronica. Per iniziare, procurati la normale linea cellulare duttale pancreatica umana.
Scongelare le celle a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Filtrare ora il terreno completo appena preparato attraverso un filtro a siringa. Aggiungere sei millilitri di terreno completo a un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Quindi trasferire la sospensione cellulare scongelata nel tubo e mescolare accuratamente. Centrifugare la sospensione a 1,800 G per sei minuti. Scartare il surnatante e aggiungere un millilitro di terreno di coltura al pellet prima di mescolare delicatamente.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno completo in una capsula di Petri da 60 millimetri. Quindi pipettare la sospensione cellulare goccia a goccia nel pallone. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con un'integrazione di anidride carbonica del 5%.
Per modificare il pH del terreno di coltura, preparare innanzitutto 100 millilitri di soluzioni madre di fosfato di sodio 0,5 molari con valori di pH di 6,0, 6,5 e 7,0. Controllare il pH con un pHmetro e regolarlo utilizzando un acido cloridrico molare o un idrossido di sodio molare. Quindi filtrare, sterilizzare i tamponi in una cappa a flusso d'aria laminare utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri.
Quindi, aggiungere 20 millilitri di tampone fosfato di sodio sterile 0,5 molare del rispettivo pH a 80 millilitri di terreno di coltura per preparare terreni di pH diverso. Aggiungere il terreno con il pH alterato all'85-90% di cellule duttali pancreatiche umane confluenti. Osservare i cambiamenti morfologici al microscopio a campo chiaro a intervalli di un'ora per sei ore.
Per isolare l'RNA dalla coltura, aspirare prima il terreno di coltura e sciacquare le cellule con un millilitro di PBS. Mettere il piatto da 60 millimetri sul ghiaccio, quindi un millilitro di PBS sul piatto da 60 millimetri e raschiare le cellule con un raschietto cellulare. Ora trasferisci la sospensione in un nuovo tubo.
Centrifugare a 8.000 g per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Successivamente, aggiungere al pellet 600 microlitri di tampone di lisi contenente beta-mercaptoetanolo. Pipettare la sospensione su e giù per cinque-10 minuti con ghiaccio.
Aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% al lisato e pipettare la sospensione per miscelare accuratamente. Trasferire la soluzione in una colonna di membrana di silice. Quindi centrifugare la colonna a più di 8.000 G per 30 secondi ed eliminare il flusso.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio al campione e centrifugare nuovamente. Centrifugare la provetta vuota per un minuto a più di 8.000 G.Infine, aggiungere alla colonna da 30 a 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, centrifugare nuovamente la colonna a velocità superiori a 8.000 G per cinque minuti.
È stata osservata una significativa riduzione delle dimensioni delle cellule e il restringimento delle cellule duttili in un mezzo acido rispetto alle cellule mantenute in un mezzo normale. I cambiamenti più pronunciati nella morte cellulare si sono verificati dopo sei ore di incubazione con un'ulteriore diminuzione della conta cellulare e segni di stress cellulare a 22 ore. Il numero di geni sovraregolati era più alto a pH 6,5 con 148 geni, seguito da pH sette con 109 geni e pH 6 con 90 geni.
I geni sottoregolati erano meno con 20 a pH sei, 14 a pH 6,5 e 23 a pH sette. Tre oncogeni, LCK, FGR e ASAP 3, sono stati sovraregolati in tutti i livelli di pH testati, suggerendo un ruolo nella proliferazione cellulare in condizioni acide.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio esplora come la diminuzione del pH influisce sull'espressione degli oncogeni nelle cellule duttali pancreatiche attraverso l'analisi RNA-seq. I risultati suggeriscono un legame tra ambienti acidi e aumento dell'espressione degli oncogeni, il che potrebbe orientare future ricerche sul carcinoma duttale pancreatico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Biologia cellulare
- Espressione genica
Sfondo
- Le secrezioni duttali pancreatiche possono diminuire, portando a livelli alterati di pH.
- Microambienti acidi possono influenzare l'espressione genica nelle cellule duttali pancreatiche.
- L'eterogeneità dei tumori pancreatici complica il trattamento e la ricerca.
- Comprendere l'espressione degli oncogeni in queste condizioni è fondamentale per la ricerca sul cancro.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti della riduzione del pH sull'espressione degli oncogeni nelle cellule duttali pancreatiche.
- Esplorare i meccanismi di adattamento cellulare agli ambienti acidi.
- Fornire informazioni sul ruolo degli oncogeni nel cancro del pancreas in condizioni infiammatorie.
Metodi Utilizzati
- Analisi RNA-seq di cellule duttali pancreatiche.
- Confronto dell'espressione genica in condizioni di pH normale e ridotto.
- Focus sui cambiamenti nell'espressione degli oncogeni.
- Valutazione di possibili collegamenti tra ambienti acidi e attività degli oncogeni.
Risultati principali
- È stata osservata un'espressione aumentata di tre oncogeni in condizioni di pH ridotto.
- I risultati suggeriscono un possibile legame tra ambienti acidi e l'espressione degli oncogeni.
- Lo studio evidenzia l'importanza del pH nella biologia delle cellule duttali pancreatiche.
- I risultati potrebbero contribuire ad approfondire la comprensione del carcinoma adenocarcinoma duttale pancreatico.
Conclusioni
- Un pH alterato influisce in modo significativo sull'espressione degli oncogeni nelle cellule duttali pancreatiche.
- Le future ricerche dovrebbero valutare il ruolo degli oncogeni nell'insorgenza tumorale in condizioni infiammatorie.
- Questo studio fornisce le basi per ulteriori indagini sui meccanismi del cancro del pancreas.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere come i microambienti acidi regolino l'espressione degli oncogeni nelle cellule duttali pancreatiche affronta una sfida fondamentale nella biologia del cancro precoce e nella validazione degli obiettivi terapeutici. Questo flusso di lavoro basato su RNA-seq consente una riduzione del rischio meccanicistica collegando gli stress ambientali all'attivazione genica, fornendo informazioni per modelli predittivi sull'insorgenza tumorale in contesti infiammatori. L'approccio supporta le decisioni di portafoglio chiarificando il rischio biologico in sistemi pertinenti alla malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dell'attivazione di oncogeni in condizioni acide fisiologicamente rilevanti.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistica mappando le variazioni dell'espressione genica in risposta a stress ambientali.
- Chiarisce il ruolo del pH del microambiente nella validazione funzionale di target nel cancro del pancreas.
- Fornisce indicazioni sulla fiducia predittiva per la selezione precoce del portafoglio nei programmi di oncologia.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un sistema cellulare validato per la valutazione dell'espressione genica in condizioni di pH controllato.
- Facilita flussi di lavoro riproducibili di RNA-seq per la valutazione quantitativa dell'espressione differenziale dei geni.
- Permette la standardizzazione delle condizioni del saggio per lo screening di composti successivi in microambienti acidi.
- Fornisce output quantitativi per valutare la prontezza del saggio e la scalabilità della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro a fattori microambientali rilevanti per la malattia osservati nella pancreatite cronica e nel carcinoma duttale del pancreas (PDAC).
- Supporta la continuità traslazionale modellando gli stimoli di iniziazione tumorale in sistemi preclinici.
- Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio basate su approfondimenti meccanicistici sull'attivazione degli oncogeni.
- Incrementa il valore predittivo per la scoperta di biomarcatori nella tumorigenesi indotta dall'infiammazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro di RNA-seq utilizza la modulazione del pH acido come strumento nella fase di scoperta per collegare lo stress ambientale all'attivazione di oncogeni, creando un ponte tra la verifica iniziale delle ipotesi e lo sviluppo di modelli preclinici.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'impatto dello stress acido sull'espressione genica e sul rischio di inizio tumorale.
- Screening: Fornisce una piattaforma riproducibile e quantitativa per valutare le variazioni dell'espressione genica lungo gradienti di pH.
- Analisi: Fornisce dati sull'espressione genica differenziale per confrontare l'attivazione di oncogeni in condizioni definite.
- Ricerca Translazionale: Modella microambienti rilevanti per le malattie al fine di guidare strategie di validazione preclinica.
- Riutilizzo Aziendale: Offre un flusso di lavoro scalabile adattabile ad altre linee cellulari e variabili ambientali nella ricerca oncologica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi collegando i fattori ambientali all'espressione degli oncogeni.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di sequenziamento dell'RNA e di coltura cellulare per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Informa le decisioni di proseguimento o interruzione chiarificando i rischi meccanicistici nei programmi oncologici precoci.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli e dei modelli corretta in base al rischio, sulla base della risposta agli stimoli ambientali.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella modulazione del pH e nell'analisi di dati RNA-seq.
- Necessita dell'accesso a piattaforme di sequenziamento di nuova generazione e a strumenti di bioinformatica per l'analisi dell'espressione differenziale.
- Richiede una rigorosa standardizzazione interdisciplinare dei protocolli di regolazione del pH e di lavorazione dei campioni.
- L'adattamento ad altri tipi cellulari o modelli di malattia potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri ambientali.
- L'interpretazione delle variazioni nell'espressione genica deve tenere conto delle limitazioni legate alla vitalità cellulare e alla risposta allo stress.
