Name: Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Impara l'isolamento di adipociti maturi murini da diversi depositi di grasso e condizioni dietetiche. Questo protocollo scalabile utilizza collagenasi e DNase per studiare la funzione cellulare in obesità.

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<meta charset="utf8"></head><body>Coltura di adipociti murini ed espianti per studi funzionali e di imaging

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxamer 188 soluzione</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conico</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G Ago</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Siringa</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Conica Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell con 0,4 &; m Inserto a membrana in policarbonato</td> poro <td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Plasma Membrane Stains</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 sale disodico</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi in polvere</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM no feonol Red</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher scientifico</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>Punta per pipetta con caricamento in gel</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX</td><td>Kit</td><td></td> per il dosaggio del glicerolo 35050061 <td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Soluzione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitatore per incubazione</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori per imaging SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (filtro per cocktail a maglia fine SteeL)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Come mostrato nella Figura 2, una corretta macinazione (Figura 2B) e digestione (Figura 2C) sono importanti per l'isolamento degli adipociti maturi intatti. La macinazione e la digestione insufficienti possono portare a una bassa resa di adipociti maturi a causa di una separazione inadeguata dal tessuto connettivo. Visivamente, questo può essere osservato con tessuto filamentoso che rimane dopo la macinazione e grumi visibili nella soluzione di collagenasi. Inoltre, l'eccessiva macinazione e digestione eccessiva provocano anche una bassa resa a causa dello scoppio degli adipociti maturi. Visivamente, ciò si traduce nella perdita dello strato bianco opaco e nell'accumulo di uno strato lipidico ampio, chiaro e libero. Livelli inappropriati di macinazione o digestione si tradurranno in uno scarso isolamento degli adipociti.
Una corretta preparazione e digestione del tessuto adiposo comporterà la separazione del tessuto in quattro strati distinti, come si vede nella Figura 3. È inevitabile un certo scoppio degli adipociti con conseguente rilascio di lipidi liberi; Tuttavia, una corretta macinazione e digestione garantirà una rottura minima degli adipociti. Lo strato lipidico libero rimanente e il terreno saranno rimossi durante l'impacchettamento degli adipociti (Figura 4). Il corretto impacchettamento degli adipociti è essenziale per l'isolamento efficiente degli adipociti maturi. Eventuali lipidi o terreni liberi rimanenti risulteranno in uno scarso isolamento e avranno un impatto negativo sui saggi funzionali a valle, come la piastra, la lipolisi e l'imaging cellulare.
Questo protocollo genera una preparazione pulita di adipociti maturi. I test di imaging cellulare e lipolisi possono essere eseguiti per valutare la funzione cellulare e dimostrare che gli adipociti maturi mantengono la funzione dopo l'isolamento e dopo la coltura per un massimo di due settimane. Il test di lipolisi indica che gli adipociti maturi mantengono la capacità di rispondere alla segnalazione cellulare attraverso il rilascio di glicerolo libero dopo la stimolazione del recettore adrenergico β-3 (Figura 6A, B). Questa capacità viene mantenuta anche dopo 2 settimane in coltura ed è altamente paragonabile all'attività di lipolisi degli espianti di tessuto adiposo coltivati per 24 ore (Figura 6C, D). Gli adipociti di scarsa qualità mostreranno una lipolisi attenuata. L'imaging cellulare degli adipociti isolati mostra adipociti maturi uniloculare rotondi e intatti contenenti una singola grande gocciolina lipidica. Gli isolamenti di adipociti di scarsa qualità mostreranno principalmente grandi goccioline di olio extracellulari indicative di adipociti scoppiati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Figura 1: Inclusione di espianti di tessuto adiposo. (A) Immagine della cupola della matrice della membrana basale parzialmente solidificata prima dell'inclusione del tessuto. (B) Immagini rappresentative di un incorporamento improprio e corretto dei tessuti. L'inclusione impropria è visibile poiché il tessuto sembra galleggiare parzialmente o completamente sopra la cupola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Figura 2: Schema della corretta macinazione e digestione del tessuto adiposo. (A) Rappresentazione schematica delle fasi di macinazione e digestione dei tessuti 4.2-4.6. (B) Immagini rappresentative di tessuto sotto, ottimale e sovra-tritato. Il tessuto sotto-tritato ha grandi pezzi che mantengono la loro forma originale. Il tessuto tritato eccessivamente provoca un aumento visibile dei lipidi liberi che circondano il tessuto, che appaiono chiari e oleosi. (C) Immagini rappresentative di tessuto sotto, ottimale e sovradigerito. Il tessuto sottodigerito contiene pezzi di tessuto intero rimasti nella soluzione. Il tessuto eccessivamente digerito mostra un grande strato lipidico libero che si separa rapidamente dalla soluzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Figura 3: Separazione degli strati di tessuto adiposo digerito. (A) Immagine schematica e rappresentativa dei layer presenti dopo il passaggio 5.3. (B) Uso di un puntale di pipetta tagliato per rimuovere lo strato di adipociti maturi dalla provetta conica da 50 mL. (C) Tecnica e posizionamento corretti dell'ago e della siringa per rimuovere il terreno di coltura da sotto lo strato di adipociti maturi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Figura 4: Impacchettamento sequenziale di adipociti maturi. Immagini sequenziali dell'impacchettamento degli adipociti maturi. Gli strati di lipidi liberi, adipociti e terreni sono etichettati. Dopo ogni centrifuga, i lipidi e i terreni liberi vengono rimossi. Questo viene ripetuto fino a quando nessun mezzo o lipidi liberi si separa dagli adipociti dopo una centrifuga. L'immagine finale è rappresentativa di adipociti maturi ben imballati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Figura 5: Placcatura e coltura di adipociti maturi. (A) Schema della placcatura degli adipociti maturi. Utilizzando una punta di pipetta p200 tagliata, gli adipociti impaccati vengono posizionati sulla membrana di un foglietto illustrativo per colture cellulari. L'inserto viene quindi invertito in pozzetti preriempiti di terreno di coltura. (B) Un'immagine rappresentativa della placcatura di adipociti maturi raffigurante la punta della pipetta tagliata che deposita gli adipociti sull'inserto del pozzetto. (C) Schemi e immagini rappresentative di adipociti correttamente impacchettati e scarsamente impacchettati placcati con pozzetti, visti dall'alto dei pozzetti. Gli adipociti correttamente impacchettati appaiono bianchi e opachi, mentre gli adipociti scarsamente impacchettati provocano la formazione di goccioline lipidiche chiare. (D) Schema della tecnica utilizzata per modificare i terreni di coltura. Un puntale per pipetta p200 viene utilizzato per rimuovere con cura il fluido attraverso le aperture nella parete laterale dell'inserto del vano trans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Figura 6: Imaging di adipociti maturi e test di lipolisi. (A,B) Rilascio di glicerolo da adipociti maturi sottocutanei (A) e viscerali (B). Gli adipociti sono stati isolati da topi maschi C57BL/6 di 16 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. 30 μL di adipociti sono stati piastrati come descritto nella fase 7.1 e coltivati per 1 o 10 giorni. Gli adipociti sono stati trattati con 5 μM di CL-316.243 per 1 ora, 2 ore e 4 ore e i surnatanti sono stati raccolti e analizzati per il glicerolo libero. (C, D) Rilascio di glicerolo da espianti di tessuto adiposo sottocutaneo (C) e viscerale (D). Il tessuto adiposo è stato isolato da topi femmina C57BL/6 di 18 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. 0,1 g di espianti di tessuto adiposo sono stati piastrati come descritto nelle fasi 3.1-3.4 e coltivati per 24 ore. Gli adipociti sono stati trattati con 5 μM di CL-316.243 per 1 ora, 2 ore e 4 ore e i surnatanti sono stati raccolti e analizzati per il glicerolo libero. N = 3 repliche tecniche per A-D. Tutti i dati sono medi ± deviazione standard. (E) Immagini rappresentative di adipociti maturi isolati sottocutanei e viscerali. Gli adipociti sono stati isolati da topi maschi C57BL/6J di 16 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. Gli adipociti sono stati colorati con la colorazione della membrana plasmatica (rosso) e con la colorazione dei nuclei di Hoechst (blu). Barre di scala: 50 μm; ingrandimento: 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sesso</td>
			<td>Dieta</td>
			<td>Deposito</td>
			<td>Difficoltà di tritatura</td>
			<td>Collagenasi: Rapporto tissutale</td>
			<td>Tempo di digestione suggerito (min)</td>
			<td>Temperatura di centrifuga.</td>
			<td>Temp. di lavaggio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Femmina</td>
			<td rowspan="2">Chow normale</td>
			<td>Sottocutaneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscerale</td>
			<td>Medio</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta ricca di grassi</td>
			<td>Sottocutaneo</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscerale</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Maschio</td>
			<td rowspan="2">Chow normale</td>
			<td>Sottocutaneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscerale</td>
			<td>Medio</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta ricca di grassi</td>
			<td>Sottocutaneo</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscerale</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Sesso, deposito e modifiche specifiche della dieta. La difficoltà di macinazione di ciascun tessuto, descritta come "Facile", "Media" o "Difficile" in relazione ad altri depositi. Si noti che il tempo di macinazione effettivo varia a seconda del ricercatore e del tessuto. Collagenasi: Rapporto tissutale indicato come volume (mL) di soluzione di collagenasi + DNasi preparata al punto 4.1 rispetto al peso del tessuto (g). Il tempo di digestione è una stima approssimativa, ma il tempo di digestione effettivo varia in base al macinato e al tessuto. I ricercatori dovrebbero valutare la digestione come descritto nel protocollo. La temperatura di centrifuga e la temperatura di lavaggio differiscono tra topi maschi e femmine. RT indica la temperatura ambiente.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

La nostra ricerca si concentra sullo studio della funzione degli adipociti maturi provenienti da diversi depositi di grasso e condizioni dietetiche. Siamo specificamente interessati a capire come gli adipociti maturi comunicano con le cellule circostanti e come questo crosstalk può influenzare la progressione della malattia ed essere alterato nell'obesità. Gli adipociti maturi sono cellule grandi e delicate, il che rende inefficaci i metodi di isolamento cellulare comunemente usati come il FACS.Inoltre, alti livelli di lipidi liberi che si trovano spesso nel tessuto adiposo possono essere tossici per gli adipociti maturi, complicando il loro mantenimento. A differenza dei metodi comunemente usati che si basano sulla differenziazione in vitro dei preadipociti, questo protocollo ci consente di studiare gli adipociti isolati ex vivo, che sono funzionalmente e trascrizionalmente come gli adipociti in vivo. Ciò è particolarmente importante in quanto gli adipociti variano notevolmente tra i depositi di grasso e in diverse condizioni dietetiche.Questo protocollo isola in modo efficiente, rispecchiando gli adipociti maturi ed è facilmente scalabile. Sono inclusi aggiustamenti per ottimizzare l'isolamento degli adipociti da topi di sesso diverso e con diverse condizioni dietetiche. Una volta isolati, gli adipociti possono essere coltivati, sottoposti a imaging o utilizzati in altro modo secondo necessità.Per iniziare, preparare una soluzione di collagenasi con DNasi aggiungendo 0,00017 grammi di DNasi per un millilitro di soluzione di collagenasi e agitare la miscela per garantire una miscelazione completa. Usando una lama di rasoio, tritare il tessuto adiposo dei topi isolati fino a farlo apparire omogeneo. Quindi trasferire il fazzoletto macinato in una provetta conica sterile da 50 millilitri.Aggiungere la soluzione preparata di collagenasi e DNasi al tessuto adiposo tritato e agitare alla massima velocità per sette-10 secondi per mescolare accuratamente i componenti. Quindi posizionare le provette coniche da 50 millilitri orizzontalmente in uno shaker impostato a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere le provette, agitare per cinque secondi e controllare i campioni.Ora, utilizzando una pipetta sierologica, passare il tessuto digerito attraverso un setaccio in una nuova provetta conica sterile da 50 millilitri. Aggiungere FBS pari al volume del tessuto e della soluzione di collagenasi attraverso il setaccio nello stesso tubo conico per neutralizzare la collagenasi. Centrifugare i tubi a 300 G per tre minuti alla temperatura specificata nella tabella riportata di seguito.Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, scartare con cura lo strato superiore di lipidi liberi. Successivamente, utilizzare una pipetta P1000 con la punta tagliata per trasferire gli adipociti maturi in una provetta da 15 millilitri preparata contenente 10 millilitri di terreno di crescita. Capovolgere delicatamente le provette da 15 millilitri contenenti adipociti maturi da tre a cinque volte fino a quando lo strato bianco non si disperde in tutto il terreno.Dopo aver fatto riposare i tubi per 10 minuti, centrifugarli alla temperatura precedentemente determinata per separare ulteriormente gli strati. Successivamente, utilizzare una pipetta per scartare lo strato superiore di lipidi liberi. Ora collega un ago calibro 21 a una siringa da cinque millilitri e fai scorrere con cautela l'ago lungo il bordo del tubo fino a quando la parte inferiore dell'ago non si trova al di sotto dello strato del sito degli adipociti maturi.Quindi sollevare lentamente la siringa per rimuovere il terreno di coltura ed eventuali detriti cellulari. Aggiungere delicatamente 10 millilitri di terreno di coltura alla provetta. Uso dei puntali delle pipette per il caricamento del gel Far scorrere il puntale lungo il bordo della provetta per rimuovere il terreno rimanente da sotto lo strato di adipociti maturi.Quindi centrifugare le celle a 100 G per un minuto. Utilizzando una pipetta, rimuovere i lipidi liberi. Utilizzando un puntale per pipetta con caricamento in gel, rimuovere il terreno di coltura sotto gli adipociti.Rimuovere gli inserti di coltura cellulare da una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale e posizionarli con la membrana rivolta verso l'alto sulla superficie della cappa. Riempire i pozzetti alternati della piastra con terreno di coltura caldo. Utilizzando un puntale per pipetta P200 tagliato, trasferire 30 microlitri di adipociti maturi impacchettati sulla parte superiore di un inserto Transwell.Quindi prelevare con cautela l'inserto Transwell, capovolgerlo e posizionarlo in un pozzetto preriempito nella piastra a 24 pozzetti. Per rimuovere il terreno dai pozzetti, tenere fermo l'inserto Transwell e aspirare con una pipetta P200 attraverso le piccole aperture sui lati. Dopo aver rimosso il terreno, tenendo ancora il Transwell in posizione, aggiungere lentamente un millilitro di terreno fresco lungo la parete laterale del pozzetto.

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Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

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Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

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Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

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Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

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Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

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Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Impara l'isolamento di adipociti maturi murini da diversi depositi di grasso e condizioni dietetiche. Questo protocollo scalabile utilizza collagenasi e DNase per studiare la funzione cellulare in obesità.

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