Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

La nostra ricerca si concentra sullo studio della funzione degli adipociti maturi provenienti da diversi depositi di grasso e condizioni dietetiche. Siamo specificamente interessati a capire come gli adipociti maturi comunicano con le cellule circostanti e come questo crosstalk può influenzare la progressione della malattia ed essere alterato nell'obesità. Gli adipociti maturi sono cellule grandi e delicate, il che rende inefficaci i metodi di isolamento cellulare comunemente usati come il FACS.

Inoltre, alti livelli di lipidi liberi che si trovano spesso nel tessuto adiposo possono essere tossici per gli adipociti maturi, complicando il loro mantenimento. A differenza dei metodi comunemente usati che si basano sulla differenziazione in vitro dei preadipociti, questo protocollo ci consente di studiare gli adipociti isolati ex vivo, che sono funzionalmente e trascrizionalmente come gli adipociti in vivo. Ciò è particolarmente importante in quanto gli adipociti variano notevolmente tra i depositi di grasso e in diverse condizioni dietetiche.

Questo protocollo isola in modo efficiente, rispecchiando gli adipociti maturi ed è facilmente scalabile. Sono inclusi aggiustamenti per ottimizzare l'isolamento degli adipociti da topi di sesso diverso e con diverse condizioni dietetiche. Una volta isolati, gli adipociti possono essere coltivati, sottoposti a imaging o utilizzati in altro modo secondo necessità.

Per iniziare, preparare una soluzione di collagenasi con DNasi aggiungendo 0,00017 grammi di DNasi per un millilitro di soluzione di collagenasi e agitare la miscela per garantire una miscelazione completa. Usando una lama di rasoio, tritare il tessuto adiposo dei topi isolati fino a farlo apparire omogeneo. Quindi trasferire il fazzoletto macinato in una provetta conica sterile da 50 millilitri.

Aggiungere la soluzione preparata di collagenasi e DNasi al tessuto adiposo tritato e agitare alla massima velocità per sette-10 secondi per mescolare accuratamente i componenti. Quindi posizionare le provette coniche da 50 millilitri orizzontalmente in uno shaker impostato a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere le provette, agitare per cinque secondi e controllare i campioni.

Ora, utilizzando una pipetta sierologica, passare il tessuto digerito attraverso un setaccio in una nuova provetta conica sterile da 50 millilitri. Aggiungere FBS pari al volume del tessuto e della soluzione di collagenasi attraverso il setaccio nello stesso tubo conico per neutralizzare la collagenasi. Centrifugare i tubi a 300 G per tre minuti alla temperatura specificata nella tabella riportata di seguito.

Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, scartare con cura lo strato superiore di lipidi liberi. Successivamente, utilizzare una pipetta P1000 con la punta tagliata per trasferire gli adipociti maturi in una provetta da 15 millilitri preparata contenente 10 millilitri di terreno di crescita. Capovolgere delicatamente le provette da 15 millilitri contenenti adipociti maturi da tre a cinque volte fino a quando lo strato bianco non si disperde in tutto il terreno.

Dopo aver fatto riposare i tubi per 10 minuti, centrifugarli alla temperatura precedentemente determinata per separare ulteriormente gli strati. Successivamente, utilizzare una pipetta per scartare lo strato superiore di lipidi liberi. Ora collega un ago calibro 21 a una siringa da cinque millilitri e fai scorrere con cautela l'ago lungo il bordo del tubo fino a quando la parte inferiore dell'ago non si trova al di sotto dello strato del sito degli adipociti maturi.

Quindi sollevare lentamente la siringa per rimuovere il terreno di coltura ed eventuali detriti cellulari. Aggiungere delicatamente 10 millilitri di terreno di coltura alla provetta. Uso dei puntali delle pipette per il caricamento del gel Far scorrere il puntale lungo il bordo della provetta per rimuovere il terreno rimanente da sotto lo strato di adipociti maturi.

Quindi centrifugare le celle a 100 G per un minuto. Utilizzando una pipetta, rimuovere i lipidi liberi. Utilizzando un puntale per pipetta con caricamento in gel, rimuovere il terreno di coltura sotto gli adipociti.

Rimuovere gli inserti di coltura cellulare da una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale e posizionarli con la membrana rivolta verso l'alto sulla superficie della cappa. Riempire i pozzetti alternati della piastra con terreno di coltura caldo. Utilizzando un puntale per pipetta P200 tagliato, trasferire 30 microlitri di adipociti maturi impacchettati sulla parte superiore di un inserto Transwell.

Quindi prelevare con cautela l'inserto Transwell, capovolgerlo e posizionarlo in un pozzetto preriempito nella piastra a 24 pozzetti. Per rimuovere il terreno dai pozzetti, tenere fermo l'inserto Transwell e aspirare con una pipetta P200 attraverso le piccole aperture sui lati. Dopo aver rimosso il terreno, tenendo ancora il Transwell in posizione, aggiungere lentamente un millilitro di terreno fresco lungo la parete laterale del pozzetto.