Misurazione della citometria a flusso ad alto rendimento del meccanotipo cellulare basata sulla rottura e l'erogazione di sonde di tensione del DNA nelle cellule

Il nostro laboratorio studia generalmente i meccanismi molecolari che le cellule utilizzano per veicolare gli stimoli meccanici. Recentemente, abbiamo sviluppato metodi ad alto rendimento per misurare le forze che le cellule esercitano sull'ambiente circostante per portare la meccanobiologia nell'era omica. Gli studi implicano forze meccaniche nel modo in cui le cellule T vengono attivate dall'antigene corretto e nel modo in cui le cellule staminali si differenziano in tipi di cellule specializzate.

Recentemente, il targeting dei processi alla base della meccanica cellulare disregolata ha portato allo sviluppo della meccheterapia come via per il trattamento della malattia. I sensori DNA duplex e hairpin misurano le forze extracellulari, mentre i sensori geneticamente codificati consentono misurazioni intracellulari. Quasi tutti richiedono microscopi di fascia alta.

La microscopia della forza di trazione può misurare la forza che le cellule esercitano sull'ambiente circostante, ma anch'essa coinvolge l'imaging ad alta risoluzione. In questo lavoro affrontiamo tre sfide sul campo: uno, l'utilizzo della citometria a flusso per la misurazione della forza invece dell'imaging, due, l'impiego della tecnologia dei tag HOH per collegare ligandi e anticorpi alle sonde del DNA e tre, l'utilizzo di piastre di coltura cellulare standard senza speciali trattamenti superficiali. In che modo i cambiamenti delle forze generate dalle cellule possono essere utilizzati come marcatore prognostico per lo stato della malattia, e queste forze contribuiscono o sono un effetto secondario di detto stato patologico?

Per iniziare, assemblare i duplex in un rapporto molare di 1,1 a uno del filo di ancoraggio con il trequenziere al filamento del legante con fluoroforo. Preparare i duplex a una concentrazione finale di 40 filamenti di leganti micromolari nella soluzione. Per ricuocere i duplex assemblati, incubarli a 98 gradi Celsius per cinque minuti.

Poi, lasciate raffreddare il composto a temperatura ambiente per un'ora al riparo dalla luce. Far reagire i duplex ricotti con HUH utilizzando la concentrazione del filamento meno abbondante dalla fase di ricottura, che in questo caso è il filamento del ligando. Mescolare i duplex con HUH in un rapporto molare da uno a due a una concentrazione finale di 10 micromolari duplex e 20 micromolari HUH.

Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore o in un blocco termico protetto dalla luce. Dopo l'incubazione, rimuovere la reazione dal calore e utilizzare una mini centrifuga da banco per far girare i cavi del tensiometro ora assemblati, o TGT. Quando i TGT aderiscono adeguatamente, lavare i pozzetti con le cellule desiderate tre volte con PBS.

Seguire questo con due lavaggi utilizzando terreni privi di siero e lasciare il terreno nei pozzetti dopo il lavaggio finale. Aggiungere 200 microlitri di PBS ai pozzetti periferici per mitigare gli effetti dei bordi. Trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per preriscaldare la piastra.

Quindi, recupera le celle di interesse a circa l'80% di confluenza. Aspirare il terreno, quindi lavare le cellule con PBS e incubare le cellule con tripsina a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si dissociano, il che richiede circa 5-10 minuti. Una volta dissociate le cellule, aggiungere il volume originale del terreno cellulare completo utilizzato per mantenere le cellule.

Risospendere le cellule utilizzando una pipetta sierologica e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 300 G per quattro minuti. Aspirare il fluido e risospendere il pellet in PBS.

Dopo aver ripetuto la centrifugazione, risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno privo di siero e centrifugare nuovamente. Aspirare e risospendere le cellule in circa due millilitri di terreno privo di siero. Determinare la densità delle celle risospese per regolare la concentrazione come desiderato.

Facoltativamente, se si testano gli effetti del farmaco, aggiungere la concentrazione appropriata del farmaco alle cellule e rimettere le cellule nell'incubatore per il tempo di pre-incubazione prima di procedere. Ora, recupera la piastra originale dall'incubatore e rimuovi il terreno residuo rimasto dal lavaggio nei pozzetti sperimentali. Lavare i pozzetti una volta con il terreno desiderato e pipettare 100 microlitri di cellule risospese nei pozzetti desiderati.

Trasferire le cellule piastrate nell'incubatore per 90 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere circa 125-170 microlitri di volume da ciascun pozzetto. Se necessario, lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di PBS riscaldato.

Quindi, incubare le cellule in ciascun pozzetto con 50 microlitri di tripsina fino a quando le cellule iniziano a dissociarsi, il che richiede circa 5-10 minuti. Quindi, aggiungi 160 microlitri di tampone di flusso appena preparato a ciascun pozzetto. Pipettare delicatamente su e giù per dissociare le cellule.

Trasferire 196 microlitri di questa sospensione cellulare in provette per PCR, aggiungere quattro microlitri di ioduro di propidio e mescolare delicatamente. Infine, posizionare le provette in un secchiello per il ghiaccio con un coperchio che blocca la luce e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando un citometro a flusso. Il gating con citometria a flusso ha confermato il successo dell'isolamento di singole cellule vive, garantendo un'analisi accurata del meccanotipo.

Un gating di controllo negativo, impostato al 99° percentile della fluorescenza Cy5-A, ha fornito una base per il confronto delle condizioni sperimentali. Le cellule CHO-K1 trattate con Y27632 hanno mostrato una diminuzione significativa della percentuale di cellule che hanno superato il cancello di controllo negativo sui TGT di taglio, mentre i TGT unzipping hanno mostrato solo una diminuzione modesta e statisticamente insignificante. L'apertura dei TGT ha comportato costantemente una percentuale più elevata di cellule che superavano il controllo negativo rispetto ai TGT di taglio, confermando il loro minore requisito di forza.