Imaging di cellule vive con fotografia time lapse per studiare la cinetica di proliferazione dei cheratinociti epidermici

Questa ricerca si concentra sulle malattie iperproliferative e ipoproliferative come la psoriasi e l'invecchiamento, con particolare attenzione a come queste condizioni influenzano la proliferazione delle cellule staminali e delle cellule progenitrici. Identificare i siti specifici dei difetti proliferativi permetterà lo sviluppo di terapie mirate più precise. Per l'epidermide umana, non abbiamo avuto tecniche che permettano di tracciare progenitori congenitori per più generazioni.

Infine, l'imaging a cellule vive ci permette di seguire un progenitore impegnato attraverso più generazioni in vitro e ha fornito molte intuizioni sul comportamento dei progenitori umani impegnati. Abbiamo utilizzato l'imaging delle cellule vive per dimostrare che, sebbene sappiamo che le cellule staminali si dividono meno frequentemente rispetto ai progenitori impegnati, quando si dividono, si dividono più rapidamente. Quando si verificano danni tissuti, le cellule staminali possono rispondere tramite un rapido ricambio.

Per cominciare, ottieni cheratinociti da pelle umana fresca. Determinare la densità di semina appropriata per il saggio e eseguire studi pilota utilizzando campioni a diluizione multipla provenienti da diversi donatori. Per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule, si attribuisce il mezzo totale necessario per tutti i pozzi a una specifica diluizione in un microtubo.

Pipetta il numero totale di cellule necessarie per raggiungere la densità desiderata nell'aliquota e inverti delicatamente il microtubo per distribuire omogeneamente le cellule. Ora, aggiungi la sospensione alle piastre. Dopo la placcatura, muovi la piastra in forma di croce tre volte su, giù, poi sinistra, destra e trasferisci con attenzione la piastra nell'incubatrice.

Dopo l'incubazione, cambia il mezzo. Per aprire l'incubatore del sistema di immagini, premi il grande pulsante triangolare in basso a sinistra. Quando la luce diventa verde, posiziona la nave in una baia aperta e chiudi il vassoio usando lo stesso pulsante.

Ora apri l'applicazione sul computer e accedi usando l'identificazione utente e la password appropriate. Poi seleziona Programma. Premi il pulsante Plus sotto il Programma per aggiungere il piatto al Programma.

Seleziona Scansiona in programma, poi clicca su Avanti. Poi seleziona Nuovo e scegli Standard per Tipo di scansione. Per le impostazioni di scansione, seleziona l'aderente Cella per Cella usando il canale di fase a 10x Obiettivo, poi clicca su Avanti.

Poi, scegli il Recipiente e poi clicca su Avanti. Seleziona una baia vuota per posizionare la nave, poi clicca su Next. Seleziona i pozzi da scansionare, così come il numero di immagini per pozzo, poi clicca su Next.

Dai un nome all'esperimento usando la convenzione di denominazione desiderata. Crea una mappa a lastre dell'esperimento per riferimento futuro. Poi clicca su Ok.

Ora clicca su Avanti per continuare. Rimandare l'analisi fino a dopo la raccolta dei dati, poiché l'analisi Cell by Cell deve essere avviata dopo la scansione. Clicca di nuovo su Next.

Imposta la frequenza delle immagini a intervalli di 20 minuti per monitorare in modo affidabile la mitosi, che avviene approssimativamente ogni 30 minuti. Premi Avanti e conferma le impostazioni per iniziare l'esperimento. Cambia il substrato per i cheratinociti ogni 48 ore.

Per garantire la corretta orientazione della placca, attendi che la prima scansione si completi ogni volta che un contenitore viene inserito nella macchina. Posiziona la lastra in modo che le lettere che indicano le file siano sul lato sinistro della baia. Segui le colonie adulte per circa due settimane e quelle neonatali per circa 10 giorni, periodo in cui l'affollamento riduce la qualità analitica.

Una volta che tutti i pozzi sono diventati inattivi o hanno raggiunto la confluenza, clicca sulla scheda Visualizza e fai doppio clic sull'esperimento sotto l'elenco delle truffe recenti. Clicca sull'icona Paesaggio con la freccia e aspetta che si avvii lo strumento Esportazione. Clicca su Come visualizzato, poi clicca su Avanti.

Poi clicca manualmente su ogni campo di visualizzazione per Esportare e poi clicca su Avanti. Seleziona se si desidera un film o una serie di immagini. Per il tracciamento della linea dei cheratinociti, scegli l'opzione Film e seleziona tutte le scansioni usando l'icona Seleziona Tutti e clicca su Next.

Esporta a un fotogramma al secondo alla massima qualità dopo aver regolato la barra accanto a Qualità. Dopo aver scelto la cartella di destinazione e il tipo di file, dà un nome al file e clicca su Esporta. Apri il file video usando un lettore multimediale e scorre tra i video per identificare le colonie in crescita.

Con VLC, fai uno screenshot della colonia da tracciare e etichettala. Identifica una colonia di interesse sia alla fine che dopo alcuni giorni di registrazione video. Riavvolge il video e identifica la cellula che forma la colonia.

Metti in pausa il video quando la cellula sta per dividersi perché sembra condensarsi. Annota il timestamp mostrato nell'angolo in basso a sinistra. Fai uno screenshot della divisione e etichettala come la colonia.

Documenta ogni divisione utilizzando un diagramma di lineage disegnato a mano. Trascrivi l'albero di linea manuale in schede dati chiamate fogli verdi a causa del colore dei fogli di calcolo. Infine, usa i fogli verdi per calcolare le proporzioni di divisioni proliferative e di differenziazione.

Identificare le colonie di cellule staminali e progenitori consolidati e determinare la durata del ciclo cellulare. I cheratinociti primari hanno mostrato una progressione stereotipata nell'aspetto, iniziando come piccole cellule arrotondate al momento della semina iniziale, per poi diventare appiattite e mobili. Iniziano a condensarsi prima della divisione e formano colonie proliferative o colonie terminalmente differenziate con morfologia non uniforme.

Una volta costruito il foglio verde, si possono determinare quali colonie provengono da cellule staminali e quali da progenitori impegnati.