Isolamento e identificazione di ceppi batterici dalla pelle di anfibi terrestri

Questa ricerca mirava a sviluppare un protocollo efficiente per la raccolta del microbiota cutaneo dagli anfibi terrestri selvatici e a garantire l'integrità microbica durante lo stoccaggio e la manipolazione.

Le sfide principali includono la prevenzione della contaminazione dei campioni, il mantenimento della vitalità microbica durante la conservazione e la coltura della crescita lenta per valutare appieno la diversità del microbiota cutaneo degli anfibi.

È stato stabilito che la soluzione salina arricchita con glicerolo preserva l'integrità del microbiota cutaneo degli anfibi durante lo stoccaggio e la manipolazione, la coltura batterica coerente e il miglioramento delle strategie di conservazione microbica per la ricerca ecologica e biotecnologica.

Questo protocollo affronta la mancanza di metodi di campionamento standardizzati, preserva e gestisce i batteri della pelle degli anfibi coltivabili e garantisce l'integrità della comunità.

[Narratore] Per iniziare, sterilizzare il terreno in autoclave a una temperatura compresa tra 121 e 134 gradi Celsius per 15-30 minuti. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare il terreno di coltura agar a circa 45-50 gradi Celsius. Sotto una cappa a flusso laminare precedentemente sterilizzata, versare il terreno raffreddato in piastre di Petri sterili. Una volta che l'agar si è solidificato, etichettare le piastre di Petri con il tipo di terreno e la data di preparazione. Miscelare il campione ottenuto dal campo con la soluzione spingendo il tampone contro le pareti della provetta mentre si stringe la provetta e ruotando accuratamente il tampone, 10 volte in senso orario e 10 volte in senso antiorario. Miscelare accuratamente il campione microbiologico prima dell'elaborazione. Preparare la diluizione seriale del campione cutaneo con una soluzione salina che va da 10 alla potenza di -1 a 10 alla potenza di -6. Inoculare 100 microlitri di campione non diluito e diluire in serie sulle piastre di agar preparate. Utilizzando un anello sterile a forma di L, striare il campione sulla superficie del terreno di agar, garantendo una distribuzione uniforme senza applicare una pressione eccessiva. Capovolgere le piastre inoculate e posizionarle all'interno di un'incubatrice impostata a 20-25 gradi Celsius per tre-cinque giorni per supportare la crescita di batteri mesofili e psicotropi sulla pelle degli anfibi. Dopo l'incubazione, selezionare colonie batteriche con morfologie distinte per ulteriori analisi. Assicurati che le colonie siano ben isolate e mostrino aspetti diversi, come variazioni di colore, dimensioni, forma, bordo, superficie o consistenza. Per sottocoltivare le colonie selezionate, trasferire una colonia ben isolata dalla piastra di agar originale a una piastra di agar fresca utilizzando un circuito di inoculazione in condizioni asettiche. Striare la colonia per isolarla. E poi incubarlo in modo appropriato. Di seguito viene mostrata la procedura di campionamento coordinata di un individuo speleomantes italicus utilizzando strumenti sterili in un ambiente di campo. Il campionamento è stato eseguito da due operatori utilizzando guanti sterili e tamponi per ridurre al minimo lo stress sull'anfibio e garantire la precisione durante la manipolazione. Il tampone è stato immediatamente trasferito in una soluzione salina con glicerolo al 20% per preservare l'integrità microbica durante il trasporto in laboratorio. Qui viene mostrato un confronto della densità della comunità microbica mantenuta in soluzione salina con e senza aggiunta di glicerolo. La carica batterica nella conservazione salina senza glicerolo era significativamente inferiore rispetto al controllo e alla soluzione salina con glicerolo. La comunità microbica conservata in soluzione salina con glicerolo ha mostrato una carica batterica simile al controllo, indicando la conservazione dell'integrità microbica. La migliore conservazione della comunità microbica è stata osservata nella soluzione salina con glicerolo conservato a quattro gradi Celsius, mostrando la carica batterica più stabile nel tempo. La conservazione in soluzione salina da sola a temperatura ambiente ha provocato la più alta crescita batterica, indicando una contaminazione microbica o una promozione selettiva di alcuni gruppi batterici. Il congelamento a meno 20 gradi Celsius ha ridotto la carica batterica, suggerendo che le basse temperature hanno avuto un impatto negativo sulla sopravvivenza microbica.