Name: Utilizzo dellassemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Impara l'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza utilizzando E. coli. Questo metodo elimina enzimi specializzati, riduce costi e tempi, raggiungendo efficienze fino al 99% per studi di ingegneria genetica.

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<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
<li>Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVA+cloning%3A+A+single-tube+universal+cloning+system+exploiting+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly.</a> Sci Rep. 6, 27459(2016).</li>
<li>Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cloning+by+homologous+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid cloning by homologous recombination in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).</li>
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<li>Stukenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Marburg+Collection%3A+A+Golden+Gate+DNA+assembly+framework+for+synthetic+biology+applications+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5alpha-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).</li>
<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Scala DNA 1 kb Plus</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500</td><td>Marcatore di peso molecolare DNA</td></tr><tr><td>AccuReady M Single Channel 0.5-10 &micro; L</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPP020</td><td>Pipette per il trasferimento di liquidi</td></tr><tr><td>AccuReady M Kit pipettatore a canale singolo</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>Pipette per il trasferimento di liquidi</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003.1</td><td>Agente solidificante per terreno di crescita</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>Realizzare gel di agarosio per elettroforesi del DNA</td></tr><tr><td>Biometra TOne&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td>Tappi termociclatori</td></tr><tr><td>per provette di coltura in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>Tappi riutilizzabili per provette di coltura in vetro</td></tr><tr><td>Primer DNA Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>N/A</td><td>Legare e amplificare il DNA modello nella reazione PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Cleave DNA modello metilato dopo l'amplificazione PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>Enzima di restrizione, viene fornito con microprovette Eppendorf tampone appropriate</td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Microprovette, 1,5 mL, base conica, PP, tappo piatto attaccato, graduazioni stampate e spazio di scrittura smerigliato</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>Agente di visualizzazione/intercalazione del DNA, tossico</td></tr><tr><td>Kit di minipreparazione del DNA plasmidico a colonna rotante EZ-10</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>Isolare il DNA plasmidico da colture batteriche notturne</td></tr><tr><td>Sistema GelDoc Go-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>Gel per DNA per imaging Provette</td></tr><tr><td>per colture in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925E</td><td>Provette per colture in vetro</td></tr><tr><td>myGel&nbsp; Mini sistema di elettroforesi</td><td>Sigma-Aldrich Z742288</td><td>Sistema utilizzato per l'elettroforesi su gel</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Determinare la concentrazione di DNA</td></tr><tr><td>PCR Clean Up per il sequenziamento del DNA</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purificare i prodotti PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>piastra Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>piastra Petri 92 x 16 mm, PS, trasparente, con camme di ventilazione</td></tr><tr><td>Punta per pipetta, 1000 &; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>Puntali per pipette per 100-1000 &; L</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta, 2,5 &; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>Puntali per pipette fino a 2,5 &; L</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta, 20 &; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>Puntali per pipette fino a 20 &; L</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta, 200 &; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>Puntali per pipette per 1-200 &; L</td></tr><tr><td>Sale (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>Componente del terreno di crescita batterica (10 g/L)</td></tr><tr><td>Provette PCR singole da 0,2 mL con tappo piatto</td><td>FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td>Provette per PCR</td></tr><tr><td>Triptone (batteriologico)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>Componente del terreno di crescita batterica (10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi DNA polimerasi</td><td>PCR</td><td>Biosystems PB10.42-01</td><td>Polimerasi ad alta fedeltà, il tampone PCR contenente Mg2+ e dNTP viene fornito con purchase</td></tr><tr><td>Xba I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Enzima di restrizione, viene fornito con un tampone appropriato</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>Componente del terreno di crescita batterica (5 g/L)</td></tr></tbody></table>

utilizzo dell'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

In questo manoscritto, come esempio di utilizzo dell'IVA, abbiamo seguito il flusso di lavoro IVA fornito per riclonare il frame di lettura aperto mCherry nel sito di clonazione multipla del plasmide pSU19 per generare un plasmide identico a pSU19mCherry (Figura 3)17. I primer adatti per l'IVA sono stati progettati sulla base delle fasi del protocollo 1.1 e 1.2. Quindi, è stato utilizzato un kit di isolamento plasmidico per isolare pSU19 e pSU18mCherry, che sono servi...

Utilizzo dell'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

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Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Fonte: Tomás, J. M., et al. Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica. J. Vis. Exp. (2022).Questo video dimostra l'amplificazione iniziatore-dipendente di un plasmide suicida in E. coli. Il plasmide, che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici, si replica solo in presenza di una proteina iniziatrice codificata dall'ospite. Dopo l'elettroporazione e l'incubazione in terreno di recupero, la miscela viene impiattata su...

Amplificazione di un plasmide suicida in un ospite batterico

Le metodologie di targeting genico possono essere utilizzate per generare topi transgenici con alleli knockout, knock-in e marcati.  Qui, descriviamo un metodo migliorato di ricombinazione in E. coli, che chiamiamo "subclonaggio più inserimento", che può essere utilizzato per generare rapidamente vettori di targeting genico personalizzati.

Subcloning più Insertion (SPI) - A Novel Metodo recombineering per la costruzione rapida di gene targeting Vettori

La sintesi di plasmidi personalizzati richiede lavoro e tempo. Questo protocollo descrive l'uso della clonazione dell'assemblaggio Gibson per ridurre il lavoro e la durata della procedura di clonazione del DNA personalizzata. Il protocollo descritto produce anche costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione nei mammiferi a un costo simile al tradizionale clonaggio del DNA taglia e incolla.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Qui presentiamo l'assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l'inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo basato sull'inserimento di siti di enzimi di restrizione in sequenze di DNA sinonimo e recupero plasmide funzionale. Questo protocollo è un metodo veloce e conveniente per fusione di geni di codifica proteica.

CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo che dimostra come la clonazione modulare (MoClo) possa essere adattata per la clonazione di operoni policistronici.

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

Lo studio attuale descrive un flusso di lavoro per il sequenziamento nanoporo dei plasmidi quando la sequenza cromosomica è già nota o non ha alcun interesse. Un primo passaggio di arricchimento del DNA plasmidico garantisce una profondità ottimale della sequenza plasmidica e massimizza il numero di campioni che possono essere sequenziati per cella di flusso.

Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

Impara l'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza utilizzando E. coli. Questo metodo elimina enzimi specializzati, riduce costi e tempi, raggiungendo efficienze fino al 99% per studi di ingegneria genetica.

Utilizzo dell'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza

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