Isolamento e analisi delle lesioni dell'arco aortico e della radice in un modello murino aterosclerotico

Lo studio indaga lo sviluppo della lesione aterosclerotica nell'arco aortico e nella radice di topi knockout per LDLR, offrendo un protocollo per l'isolamento, la colorazione e l'analisi per valutare la composizione della placca di gravità dell'aterosclerosi. Oltre all'esame istologico utilizzato in questo studio, le tecniche pratiche per valutare l'aterosclerosi includono anche marcatori biochimici, test di biologia molecolare ed ecografia vascolare. La precisione della procedura di dissezione rappresenta il più grande ostacolo tecnico nell'esecuzione dello stripping aortico in vivo all'interno del modello murino di aterosclerosi.

Per iniziare, posiziona i topi soppressi in posizione supina su un pannello di gommapiuma ricoperto da uno o due strati di carta assorbente. Fissare gli arti con perni per stabilizzare il corpo. Spruzzare etanolo al 75% sull'addome dei topi per pulire e inumidire il pelo.

Usa il forcipe per afferrare la pelle ventrale del topo. Quindi, usando le forbici sottili, taglia la pelle dalla base dell'addome alla parte superiore del collo. Apri la parete addominale e usa una pinza per sollevare lo sterno.

Tagliare sia il diaframma che le costole per esporre la cavità toracica. Rimuovere l'esofago e la trachea per facilitare la pulizia delle arterie carotidi. Rimuovere con cura gli organi tra cui fegato, polmoni, milza, tratto gastrointestinale e pancreas preservando i reni e l'aorta addominale.

Quando si sezionano le arterie mesenteriche, sollevare l'intestino e praticare incisioni lontano dall'aorta per evitare danni. Ora, posiziona il mouse sotto uno stereomicroscopio per fornire un campo di osservazione chiaro e allineare una fonte di luce fredda con l'area di dissezione. Utilizzando una siringa da 10 millilitri riempita di PBS, iniettare lentamente nell'apice ventricolare sinistro con un ago e osservare la dilatazione dell'aorta.

Asciugare delicatamente il sangue e il liquido nell'area di dissezione con carta velina per esporre completamente il campo visivo. Quindi, afferra il segmento diaframmatico dell'aorta toracica con una pinza e usa le forbici a molla per tagliare il tessuto connettivo tra l'aorta e la parete del muscolo toracico. Tirare delicatamente il cuore con una pinza e sollevare l'aorta toracica.

Osservare i rami dell'arco aortico e sezionare il grasso avventiziale e il tessuto connettivo attorno all'arco aortico e i suoi rami verso l'alto lungo l'aorta toracica. Sezionare l'aorta addominale e le arterie iliache comuni verso il basso lungo l'aorta toracica. Tagliare il tessuto cardiaco e tagliare la metà inferiore del cuore lungo un piano parallelo agli atri e posizionare il cuore tagliato in un mezzo di conservazione adatto.

Prima di sezionare l'arco aortico, posizionare una piccola guarnizione di colore scuro sotto di esso per creare contrasto. Scatta una fotografia dell'area dell'arco aortico. Taglia le arterie iliache comuni uno o due millimetri sotto la loro biforcazione e taglia i piccoli rami dell'aorta lungo la colonna vertebrale per liberarla.

Dopo aver staccato le arterie renali vicino ai reni, tagliare i tre vasi ramificati nel collo dalle loro estremità distali. Infine, tagliare l'aorta ascendente vicino al cuore. Preparare in anticipo un millilitro di soluzione di paraformaldeide al 4% in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Posizionare l'aorta nel tubo preparato e fissarlo a temperatura ambiente per almeno 24 ore. Quindi, trasferisci l'aorta in una capsula di Petri contenente PBS per evitare che si secchi. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere con cura il grasso avventiziale rimanente utilizzando una pinza e forbici a molla per ridurre l'interferenza nella quantificazione della placca.

Usando le forbici a molla, tagliare con cura l'aorta lungo il suo asse longitudinale interno. In sequenza, aprire i tre rami dell'arco aortico lungo il lato laterale fino al livello della curvatura dell'arco aortico, lasciandolo allargare completamente. A questo punto, procedere con la colorazione Oil Red O o conservare l'aorta in paraformaldeide al 4% per analisi future.

Posizionare l'aorta aperta tagliata in un piatto a sei pozzetti. Aggiungere un millilitro di acqua sterile a doppia distillazione in ogni pozzetto e lavare per cinque minuti su uno shaker. Posizionare la piastra a sei pozzetti in una cappa aspirante e asciugare all'aria per 20 minuti fino a quando non rimangono filigrane visibili.

Aggiungere un millilitro di soluzione di lavoro Oil Red O appena preparata in ogni pozzetto. Dopo aver agitato la piastra per 20 minuti, rimuovere la soluzione di Olio Rosso O dai pozzetti. Aggiungere due millilitri di acqua sterile a doppia distillazione in ogni pozzetto e lavare per cinque minuti.

Dopo tre lavaggi, conservare l'aorta in acqua distillata doppia. Trasferisci l'aorta su un vetrino e metti un cuscinetto di gomma nera sotto il vetrino per migliorare il contrasto. Allargare l'aorta durante la visione al microscopio stereoscopico.

A questo punto, posizionare la diapositiva su un foglio bianco per migliorare ulteriormente il contrasto. Posiziona un righello accanto alla diapositiva e acquisisci una fotografia utilizzando una fotocamera. Conservare l'aorta trattata in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di PBS per mantenerla umida.

Il peso corporeo dei topi knockout LDLR alimentati con una dieta in stile occidentale è aumentato significativamente rispetto a quelli alimentati con la dieta chow. I livelli plasmatici di trigliceridi e colesterolo totale erano significativamente più alti nel gruppo con dieta in stile occidentale rispetto al gruppo di controllo. La colorazione con O rosso dell'olio aortico ha mostrato un grave accumulo di lipidi nelle arterie dei topi knockout LDLR alimentati con la dieta in stile occidentale rispetto a quelli con una dieta chow.

L'aumento dei depositi lipidici è correlato a lesioni aterosclerotiche più gravi. L'area lesionata della radice aortica e il nucleo necrotico erano significativamente più grandi nei topi alimentati con dieta occidentale rispetto ai topi alimentati con dieta chow. La quantificazione dell'area lesionale della radice aortica e dell'area necrotica ha confermato che la dieta occidentale ha esacerbato la formazione di placche aterosclerotiche nei topi knockout per LDLR.