Analisi delle sottopopolazioni piastriniche mediante citometria a flusso multicolore

La nostra ricerca utilizza la citometria a flusso multicolore per identificare e caratterizzare le sottopopolazioni piastriniche, con l'obiettivo di comprendere i ruoli, i modelli di attivazione e la rilevanza clinica nella trombosi, nell'infiammazione e nel contesto specifico della malattia. Il consolidato test citometrico a flusso multicolore ha permesso di osservare il , un agonista piastrinico induce un pattern di attivazione distinto e rispetto al peptide correlato al collagene genera un procoagulante e di sottopopolazione. Il test multicolore consente la misurazione simultanea dell'attivazione piastrinica, dell'adesione, dell'aggregazione e del potenziale apoptotico di una singola piastrina all'interno di una popolazione di piastrine umane isolate in una singola provetta.

[Istruttore] Per iniziare, prepara tutti i reagenti necessari per la procedura. Ora, mescola 10 millilitri di tampone 10x Tyrode con 90 millilitri di acqua distillata. Aggiungere 0,1 grammi di glucosio e regolare il pH dell'intero volume con hepes per raggiungere 7,4. Innanzitutto, impostare il pH di 10 millilitri del tampone a 7,4, quindi regolare il pH dei restanti 90 millilitri con un acido cloridrico normale a 6,5. Per la raccolta del campione di sangue, preparare una siringa da 10 millilitri per ogni donatore con due millilitri di anticoagulante ACD. Lasciare equilibrare la siringa a temperatura ambiente. Dopo aver raccolto il sangue del donatore in una siringa ACD preriscaldata, trasferire lentamente il sangue trattato con ACD in una provetta di reazione da 15 millilitri. Centrifugare il sangue trattato con ACD a 209G per 20 minuti a temperatura ambiente senza utilizzare il break. Nel frattempo, preparare 25 millilitri di tampone Hepes di Tyrode, pH 6,5 in una provetta di reazione da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, trasferire delicatamente lo strato superiore di plasma ricco di piastrine nella provetta contenente il tampone Hepes di Tyrode. Per prevenire la contaminazione, lasciare circa un millilitro di plasma ricco di piastrine sopra il buffy coat e lo strato di eritrociti. Quindi, centrifugare la sospensione a 430 G per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le piastrine. Scartare il surnatante e risospendere con cura il pellet piastrinico in 200-300 microlitri di tampone di Tyrode, regolato a pH 7,4. Misurare la conta piastrinica utilizzando un contatore di cellule prima di regolarla a 200.000 piastrine per microlitro con il tampone Hepes di Tyrode a pH 7,4. Per i recettori che non richiedono l'attivazione prima della colorazione, inclusi CD61, CD42B, CD41, CXCR7 e CXCR4, preparare un campione non colorato e un campione colorato per anticorpo. Per recettori o marcatori che richiedono l'attivazione come PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 e zombie NIR. Attivare il campione con 10 microgrammi per millilitro di CRPXL e preparare sia i campioni attivati che quelli non attivati. Per attivare le piastrine, incubarle con 10 microgrammi per millilitro di CRPXL per 30 minuti. Quindi, incubare la piastrina isolata con concentrazioni variabili dell'anticorpo coniugato con fluorocromo o morire per 30 minuti. Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone legante l'anesina a ciascun campione per diluirlo. Misura 10.000 eventi per ogni campione utilizzando un citometro a flusso. Calcola l'indice di colorazione per ciascun anticorpo per determinare la separazione ottimale tra popolazioni positive e negative. Tracciare l'indice di colorazione rispetto alle concentrazioni di anticorpi per identificare la concentrazione ottimale per ciascun anticorpo Per la colorazione, sciogliere la polvere di emen in idrossido di sodio 1,4M per creare una soluzione 3M. Riscaldare la soluzione a 96 gradi Celsius per cinque minuti a 450 giri al minuto. Diluirlo con acqua distillata per ottenere una soluzione di gambo di tre millimolari. Dopo aver regolato la conta piastrinica a 1 milione di piastrine per campione, attivare le piastrine come dimostrato in precedenza. Aggiungere 43,3 microlitri di cocktail di anticorpi a ciascun campione e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, diluire ogni campione con 300 microlitri di un X e X in un tampone legante composto da 10 millimolari di idrossido di sodio Hepes a pH 7,4. Misurare immediatamente ogni campione colorato utilizzando il citometro a flusso. Per la compensazione con le perline, preparare 150 microlitri di PBS per ogni fluoroforo e aggiungere una goccia di perle e un microlitro di anticorpo coniugato a fluorescenza. Per compensare l'annessina V, utilizzare PECY7B sette perle marcate con CD 62L anti-umano coniugate allo stesso fluoroforo dell'annessina V. Utilizzare perle di compensazione reattiva all'ammina per il colorante reattivo all'ammina mescolando due gocce di perle positive e una goccia di perline negative in 150 microlitri di PBS con un microlitro di fustella. Verificare che le perline positive reagiscano e visualizzino un segnale e le perline negative no. Preparare una fluorescenza meno un controllo per ogni marcatore. I grafici a dispersione hanno mostrato un chiaro cambiamento nella popolazione piastrinica. Con l'emina che forma più piastrine con bassa dispersione in avanti rispetto ad altri agonisti. Il trattamento con ADP trombina e CRPXL ha portato al 40-60% di piastrine CD42 positive, mentre l'emina ha ridotto significativamente questa popolazione. Tutti gli agonisti piastrinici non hanno avuto alcun effetto sull'espressione superficiale di CD41 e CD61. Solo l'emen ha aumentato significativamente l'espressione superficiale di CXCR4 e CXCR7. Inoltre, l'esposizione alla fosfatidilserina è stata migliorata anche durante il trattamento con emina, con conseguente aumento delle cellule positive all'annessina V. Le analisi UMAP e dei grafi fenolici hanno definito 27 cluster piastrinici distinti, che variavano a seconda del tipo di agonista. Hemin ha causato il cambiamento più drammatico nei modelli di cluster. Le sottopopolazioni piastriniche a riposo sono state più conservate con ADP e affittate con emina.