FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione di come le cellule percepiscono, monitorano e regolano i molteplici loci di DNA ribosomiale all'interno del loro genoma. In particolare, miriamo a scoprire i meccanismi che distinguono quali loci di rDNA sono attivamente trascritti e come questi loci sono regolati individualmente. Recentemente abbiamo scoperto che la quantità di rDNA in una cellula può cambiare nel tempo e che questo cambiamento altera i loci di rDNA trascritti.

Ora sappiamo che le cellule cambieranno la loro trascrizione di rDNA in base alla quantità di rDNA che hanno. Questa scoperta ci porta a chiederci come le cellule sappiano quanto RDA hanno e come determinino quale locus di rDNA preferiranno esprimere. Il nostro laboratorio è ora focalizzato sulla comprensione del meccanismo che le cellule utilizzano per distinguere tra diversi loci di rDNA e percepire e regolare la loro attività.

Sotto uno stereomicroscopio, sezionare la Drosophila per isolare i testicoli nella PBS priva di RNasi. Per iniziare, afferra il centro dell'addome con un paio di pinze e l'estremità dell'addome con un altro paio per separare delicatamente l'animale. Usando una pinza, trasferisci i testicoli isolati dalla piastra di dissezione in una provetta microfusa da 1,5 millilitri contenente 0,5 millilitri di PBS privo di RNasi.

Aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di fissaggio. Porre il campione su un agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fissaggio.

Quindi lavare il campione due volte con un millilitro di PBS per cinque minuti ciascuna su uno shaker nutante. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere un millilitro di etanolo al 70% privo di RNasi e incubare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte su un agitatore nutante. Quindi, aspirare l'etanolo e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al campione.

Incubare il campione a temperatura ambiente su un agitatore per tre minuti. Dopodiché, lascia riposare il tubo in posizione verticale per due minuti. Mescolare le sonde e le maschere con il tampone di ibridazione per preparare un volume totale di 100 microlitri per campione, come mostrato qui.

Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di ibridazione al campione dopo aver aspirato il tampone di lavaggio. Applicare una pellicola trasparente per sigillare i bordi del tubo. Avvolgere la provetta in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per almeno 24 ore.

Senza aspirare la soluzione di ibridazione, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al campione. Incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti al buio. Una volta aspirato il tampone di lavaggio, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio fresco al campione e incubare nuovamente.

Al termine dell'incubazione, aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 50 microlitri di terreno di montaggio al campione. Sotto uno stereomicroscopio da dissezione, utilizzare una pipetta per trasferire il campione su un vetrino da microscopio. Utilizzando una pinza, disporre i testicoli in linea sul vetrino del microscopio per facilitare l'identificazione del campione durante l'imaging.

Coprire il campione con un vetrino coprioggetto e tamponare i bordi del vetrino coprioggetto con un panno per rimuovere il supporto di montaggio in eccesso. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con lo smalto e lasciarli al buio a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire allo smalto di asciugarsi. I segnali dell'rRNA sono stati rilevati nel nucleolo, apparendo come regioni dei pori DAPI all'interno del nucleo, in particolare nelle cellule germinali con nuclei e nucleoli grandi.

Segnali deboli e aspecifici sono stati osservati nel citoplasma in campioni privi di loci di rRNA. Nella maggior parte delle cellule, i segnali di YrRNA sono stati rilevati esclusivamente, indicando la trascrizione di rRNA dal locus di YrDNA. La co-espressione di X e YrRNA è stata osservata nelle cellule germinali, con segnali che si fondono in un singolo nucleo o si separano in due nucleoli.