Name: FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dellRNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Scopri il metodo SNP-FISH per distinguere i trascritti di rRNA dai loci rDNA X e Y in Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente di analizzare la regolazione selettiva della trascrizione rDNA nelle cellule germinali.

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<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore</td></tr><tr><td>Provette per PCR a tappo piatto da 0,2 mL a 8 strisce</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi provetta compatibile</td></tr><tr><td>Scala DNA da 1 kb</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>Da utilizzare per il controllo del sequenziamento delle dimensioni dell'amplicone PCR mediante elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Provette graduate per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Qualsiasi provetta certificata priva di RNasi farà</td></tr><tr><td>2 mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi su gel. È possibile utilizzare qualsiasi buffer TAE.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi NaCl può essere utilizzato o preparato da qualsiasi fonte</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>Qualsiasi agarosio può essere utilizzato</td></tr><tr><td>ApE - Un software di editor di plasmidi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>Smalto</td><td></td><td></td> trasparente Può <td>essere utilizzato Qualsiasi smalto per unghie di qualsiasi rivenditore Può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Vetro di copertura, n. 1 Spessore</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>destrano solfato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Utilizzato per la dissezione di campioni</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), Ph 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi prodotto comparabile</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi etanolo a prova di 200 gradi. Utilizzato per la diluizione al 70% di etanolo per la permeabilizzazione e la pulizia in condizioni prive di RNASI</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Sistema orizzontale di elettroforesi su mini gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi sistema di elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di colorazione per micro-test</td><td>Electron Scienze della microscopia</td><td>71564</td><td>Utilizzato per la dissezione di campioni</td></tr><tr><td>Agitatore di nutazione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi agitatore di nutazione</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) pH 7,4, senza RNasi</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeide (w/v), senza metanolo</td><td>Life Technologies</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua di precisione per uso generico</td><td>Life Technologies</td><td>TSGP02</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi bagno d'acqua</td></tr> Kit di <tr><td>estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi kit di estrazione del gel</td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K ricombinante (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi prodotto comparabile</td></tr><tr><td>UltraPure BSA ThermoFisher Scientific senza RNAsi</td><td></td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), senza RNasi</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>È possibile utilizzare</td></tr> <tr><td>qualsiasi prodotto comparabileTecnologie per la vita dell'acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi</td><td></td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>complesso vanadil-ribonucleosidico</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Supporti di montaggio VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Microscopio Vetrino</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster linea</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss LSM 980</td><td>Microscopia</td><td></td> Zeiss <td>È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale con emissione e rilevamento compatibili</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000-C e sorgente luminosa</td><td>Microscopio centrale</td><td>455053</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi stereomicroscopio</td></tr></tbody></table>

fish sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide rilevamento della trascrizione dell'rna ribosomiale specifico del locus in drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

Si prevede che i risultati del sequenziamento della genotipizzazione degli SNP rilevino le differenze di SNP tra i loci dell'rDNA X e Y. Questi SNP vengono rilevati valutando direttamente le posizioni degli SNP nei cromatogrammi di sequenziamento (Figura 2). Si prevede che il sequenziamento di campioni femminili abbia un singolo segnale di sequenziamento nella posizione SNP, indicando l'omozigosi SNP tra i due cromosomi X (Figura 2A). Si prevede che i risultati del sequenziamento del campione maschile abbiano un doppio picco nella posizione SNP (Figura 2B). Sulla base del genotipo del cromosoma X determinato dal sequenziamento del campione femminile, si deduce che la variante non-X è un SNP rDNA del cromosoma Y (cioè, X = T, Y = C per il sequenziamento SNP 18S nella Figura 2). In alternativa, un singolo picco di sequenziamento in una posizione SNP nel campione maschile indicherebbe l'omozigosi tra i loci di rDNA maschile e femminile in quella posizione SNP e tale posizione non sarebbe utilizzabile per rRNA SNP-FISH.
Seguendo il protocollo per SNP FISH, i campioni possono essere visualizzati mediante montaggio su vetrini e posti sotto un vetrino di copertura sigillato, seguito dalla microscopia confocale. Utilizzando le sonde elencate nella Tabella 3, il segnale dell'rRNA derivato dall'Y viene rilevato dall'emissione di Alexa Fluor 647 e il segnale dell'rRNA derivato dall'X viene rilevato dall'emissione di Alexa Fluor 488. Ci si aspetta che i segnali dell'rRNA siano osservati nel nucleolo, che può essere identificato come il buco povero di DPI nel nucleo (Figura 3A). Il nucleolo è particolarmente facile da identificare nelle cellule germinali a causa del loro nucleo e nucleolo grandi (Figura 3A). Il segnale debole può essere tipicamente trovato anche nel citoplasma (Figura 3), ma questo è un segnale non specifico che può essere rilevato anche in campioni senza rRNA contenente un SNP complementare (cioè, segnale Y in cellule prive di rDNA Y o segnale X in cellule prive di rDNA X; Figura 3B-C). Inoltre, la co-marcatura artificiale dell'rRNA X e Y può talvolta essere rilevata nel mozzo somatico, anche in campioni privi di loci di rDNA X o Y (Figura 3B-C, frecce gialle). Pertanto, solo i segnali nucleari dovrebbero essere utilizzati per valutare la trascrizione locus-specifica. La maggior parte delle cellule, in particolare le cellule somatiche, dovrebbero avere solo un segnale Y rRNA, indicando che l'rRNA è trascritto esclusivamente dal locus Y rDNA (Figura 3A, cerchio tratteggiato giallo e freccia rossa)10,17. Tuttavia, la co-espressione dell'rRNA X e Y è spesso rilevata nelle cellule germinali, in particolare nelle cellule staminali germinali13 (Figura 3A, cerchi punteggiati bianchi). I segnali dell'rRNA X e Y nelle cellule co-esprimenti possono essere adiacenti e formare un singolo nucleolo (Figura 3A cellula superiore) o possono essere separati, formando due nucleoli (Figura 3A cellula inferiore). Gli esempi nella Figura 3 sono forniti da rDNA SNP-FISH utilizzando set di sonde che hanno come bersaglio solo due SNP (i due SNP ITS1), dimostrando che solo due SNP sono necessari per rDNA SNP-FISH. Tuttavia, si osservano segnali più robusti quando si utilizzano sonde mirate a tutti e quattro gli SNP13.
I controlli negativi sono un'inclusione importante per questo test per confermare che le sonde non reagiscono in modo incrociato con il bersaglio SNP sbagliato, soprattutto quando si esegue la risoluzione dei problemi del metodo. I controlli negativi del cromosoma X includono qualsiasi condizione priva di rDNA del cromosoma X, come i maschi che ospitano un cromosoma X con una delezione di rDNA. Ci si aspetta che i controlli negativi del cromosoma X rilevino solo il segnale dell'rRNA Y e nessun rRNA X (Figura 3B). I controlli negativi del cromosoma Y includono qualsiasi condizione priva di rDNA del cromosoma Y. Alcuni esempi di queste condizioni sono i tessuti femminili XX, i tessuti di maschi privi di un cromosoma Y o i maschi che ospitano un cromosoma Y con una delezione di rDNA15. Ci si aspetta che i controlli negativi del cromosoma Y rilevino solo il segnale dell'rRNA X e non abbiano alcun segnale dell'rRNA Y rilevabile (Figura 3C). Si noti che questi controlli non sono importanti solo per determinare la specificità della sonda, ma anche per determinare eventuali background o artefatti del segnale. Eventuali nuove sonde o condizioni di saggio che forniscano specificità in tali controlli possono essere utilizzate in modo accurato per rilevare la trascrizione di rDNA locus-specifica.
Diverse condizioni genetiche, di sviluppo o ambientali possono alterare la probabilità che l'rDNA sia trascritto esclusivamente dal locus13,17 dell'rDNA del cromosoma Y. La frequenza di trascrizione dell'rDNA da un singolo locus o da più loci può essere quantificata e confrontata direttamente tra i campioni. Al fine di confrontare quantitativamente le differenze nella trascrizione del locus dell'rDNA, ogni cellula deve essere classificata individualmente come Y-dominante, Co-dominante o X-dominante. Le celle sono classificate come dominanti Y e X solo se viene rilevato solo il rispettivo segnale. Qualsiasi cellula con segnali di rRNA Y e X è considerata co-dominante, anche se un segnale è molto più debole dell'altro. Pertanto, le celle contenenti segnali X e Y molto forti sono qualitativamente considerate uguali alle celle con segnali Y forte e X debole o X forte e Y debole. La percentuale totale di tutte le cellule in tutti i campioni di ciascuna categoria può essere confrontata tra i campioni mediante il test del chi quadrato. Sebbene questo test funzioni bene per determinare qualitativamente se un particolare locus di rDNA è trascritto o meno, non abbiamo osservato valutazioni coerenti tra i campioni quando quantifichiamo direttamente l'intensità di fluorescenza dei singoli segnali SNP-FISH. Pertanto, non si consiglia di effettuare valutazioni quantitative dell'intensità del segnale FISH tra i campioni o dell'intensità relativa dei segnali di rDNA X e Y all'interno di una singola cellula. L'origine di questa incoerenza nell'intensità della fluorescenza non è chiara, anche se potrebbe essere dovuta al legame inefficiente delle sonde mascherate che non si legano a tutti gli rRNA bersaglio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema del metodo SNP-FISH. (A) Le tradizionali sonde oligonucleotidiche antisenso FISH reagiscono in modo incrociato con RNA non bersaglio che differiscono di un solo nucleotide. (B) Il metodo SNP-FISH utilizza oligonucleotidi maschera complementari legati alla regione 3' della sonda oligonucleotidica. La maschera lascia solo 10 nucleotidi liberi di legarsi alla sequenza bersaglio. Una regione della sonda non mascherata non si lega stabilmente a sequenze non bersaglio che differiscono di uno o più nucleotidi. La maschera si dissocia dalla sonda dopo che la sonda si lega al bersaglio, consentendo un legame stabile tra sonda e bersaglio. (C) Sonde SNP accoppiate con marcature diverse combinate con una maschera comune legano specificamente bersagli che differiscono per un singolo nucleotide senza reagire in modo incrociato. (D) Più sonde possono essere raggruppate insieme per etichettare in modo specifico aplotipi di rRNA distinti. Quattro differenze SNP sono state caratterizzate tra i loci di rDNA X e Y nel ceppo y1w1 di Drosophila melanogaster . Uno SNP nell'rRNA 18S, uno nell'rRNA 28S e due nella porzione ITS1 del pre-rRNA. Vengono visualizzati gli aplotipi di rRNA X e Y-specifici utilizzati per SNP-FISH. Le sonde che hanno come bersaglio la variante X dell'rDNA nei quattro SNP dell'rRNA sono coniugate a un fluoroforo comune (verde) e le sonde che hanno come bersaglio le varianti dell'rDNA Y sono coniugate a un fluoroforo diverso (magenta). Per ogni SNP viene utilizzata una maschera comune (quattro in totale). Il legame della sonda SNP-specifica in ciascuna posizione SNP sull'rRNA può marcare in modo specifico l'rRNA dai loci di rDNA X e Y con un massimo di quattro sonde oligonucleotidiche FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Figura 2: Esempi di risultati di sequenziamento di SNP di rDNA omozigoti ed eterozigoti. Esempio di cromatogrammi di sequenziamento da 18S SNP sequenziamento di DNA da (A) campioni femminili e (B) maschili. Posizione SNP 18S indicata da un asterisco (*). Il singolo segnale di timina (T) per la posizione SNP nel campione femmina indica una timina nella posizione SNP nel locus dell'rDNA del cromosoma X. Il doppio segnale in posizione SNP diviso tra timina e citosina (C) nel campione maschile indica una citosina in posizione SNP nel locus rDNA del cromosoma Y (dedotto sapendo che la timina si trova nel locus del cromosoma X). I risultati del sequenziamento sono stati visualizzati utilizzando ApE, un software di editor di plasmidi19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Figura 3: Esempi di risultati SNP-FISH nel testicolo di Drosophila utilizzando solo due set di sonde SNP-FISH. Esempi di SNP FISH nel testicolo di animali con (A) rDNA X e Y, (B) solo rDNA Y o (C) solo rDNA X. Questi esempi hanno utilizzato solo set di sonde che marcano i due SNP ITS1 rRNA, dimostrando che rRNA SNP FISH funziona con un minimo di due SNP bersaglio. Le cellule germinali sono identificate dal loro grande nucleo rotondo e le cellule somatiche dal loro nucleo più piccolo e meno rotondo. Le cellule staminali germinali sono identificate dalla loro posizione direttamente accanto al mozzo somatico, contrassegnata da un asterisco (*). Le cellule germinali che trascrivono l'rDNA da entrambi i loci X e Y dell'rDNA sono identificate da entrambi i segnali nucleari X e Y FISH (cerchi punteggiati bianchi, A-A''). Le cellule germinali che trascrivono il DNA solo dal locus Y rDNA hanno solo un segnale FISH nucleare Y (cerchio tratteggiato giallo). Le cellule somatiche che esprimono solo Y sono contrassegnate da una freccia rossa. La co-marcatura artificiale dei loci dell'rDNA X e Y può essere osservata nel mozzo somatico (freccia gialla). La barra della scala è di 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: sequenza di rRNA del locus del cromosoma X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

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Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

La purificazione dell'affinità ribosomiale traducente (TRAP) è in grado di catturare la traduzione specifica del tipo di cellula dell'mRNA. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicato all'isolamento dell'mRNA in rare popolazioni cellulari di embrioni di Drosophila.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione, il rilevamento, l'analisi e il monitoraggio del traffico di mRNA endogeno nel vivo Drosophila melanogaster camera d'uovo utilizzando fari molecolari, microscopia confocale del disco rotante, e analisi open-source software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Qui, presentiamo un protocollo di marcatura genica endogena semplificato per Drosophila, che utilizza una tecnica basata sulla PCR per l'identificazione senza marcatori di modificazioni genetiche di successo, facilitando lo sviluppo di linee knock-in stabili.

Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

La Drosophila è un modello consolidato per lo studio di molecole chiave che regolano la miogenesi. Tuttavia, i metodi attuali sono insufficienti per determinare la dinamica trascrizionale dell'mRNA e la distribuzione spaziale all'interno dei sincizi. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo ottimizzato un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA che consente il rilevamento e la quantificazione degli mRNA su scala di singola molecola.

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Scopri il metodo SNP-FISH per distinguere i trascritti di rRNA dai loci rDNA X e Y in Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente di analizzare la regolazione selettiva della trascrizione rDNA nelle cellule germinali.

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dellRNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

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