Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni
14 febbraio 2025
Manca un metodo per valutare le aree comunemente utilizzate in laboratorio per la contaminazione da prioni e un'efficace decontaminazione. Il protocollo qui descritto fornisce i fondamenti chiave per l'implementazione di un test di sicurezza con strisciamento di prioni di laboratorio che può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze individuali di laboratori specifici.
Il nostro gruppo multidisciplinare sta cercando di capire come una proteina infettiva, un prione, possa svolgere compiti biologici complessi. Siamo anche interessati a come i prioni possono persistere nell'ambiente per anni o decenni. A seguito delle procedure di decontaminazione con prioni, non era disponibile un metodo robusto per determinare l'efficacia dell'inattivazione dei prioni.
Stiamo cercando di affrontare questo problema con la nostra ricerca. Il metodo del tampone, abbinato a RT-QuIC, consente di campionare un'ampia gamma di superfici per rilevare le attività di semina dei prioni. Questo può essere utilizzato per rilevare i prioni associati alla superficie in ambienti di laboratorio, clinici o ambientali.
Sono interessato a capire come i prioni interagiscono con le superfici e i requisiti dei prioni legati alla superficie per stabilire l'infezione. Per iniziare, identificare ed etichettare le aree di sorveglianza appropriate per il tampone. Preparare due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni area identificata e aggiungere 250 microlitri di DPBS alla prima provetta, lasciando vuota la seconda.
Recuperare i tamponi con punta in schiuma dallo stoccaggio in un'area priva di contaminazione da prioni. Preparare i controlli positivi e negativi utilizzando appropriati omogeneizzati cerebrali o BH in DPBS. Utilizzando guanti puliti, prelevare il numero necessario di tamponi di schiuma dalla confezione e posizionarli con il manico rivolto verso il basso in un rack per provette.
Assicurarsi che le punte non entrino in contatto con altre superfici. Tenendo un tampone di schiuma pulito per l'impugnatura, applicare 50 microlitri dei rispettivi campioni di controllo positivi e negativi sulle punte del tampone. Usando le forbici, tagliare il manico in eccesso del tampone a circa metà della sua lunghezza e posizionare il tampone nella provetta da microcentrifuga precaricata per immergere la punta in schiuma in DPBS.
Tenendo un tampone di schiuma pulito per il manico, pre-bagnare la punta di schiuma con acqua di grado molecolare e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso. Posizionare la punta in schiuma inumidita sull'area scelta per la sorveglianza e tamponare l'area avanti e indietro circa 10 volte, ruotando contemporaneamente la punta del tampone sulla superficie. Usando le forbici, tagliare il manico in eccesso del tampone a circa metà della sua lunghezza e posizionare il tampone nella provetta per microcentrifuga precaricata per immergere la punta in schiuma in DPBS, assicurandosi che il coperchio possa chiudersi completamente.
Gettare i guanti e sostituirli con quelli nuovi prima di procedere al sito di tampone successivo per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. Per l'estrazione del tampone, posizionare la provetta per microcentrifuga in un rack circolare per provette e immergere il rack nel bagnomaria sonicatore a tromba a coppa. Assicurarsi che il tampone di schiuma nel DPBS all'interno del tubo sia sotto la superficie dell'acqua, lasciando le parti del manico non sommerse.
Sonicare il campione per un totale di 15 secondi con cicli di accensione e cinque secondi di spegnimento. Dopo la sonicazione, centrifugare la provetta per circa 15 secondi per raccogliere il DPBS sul fondo della provetta prima del trasferimento. Utilizzando una pipetta P 1000 impostata su 250 microlitri, raccogliere con cura tutto l'estratto di tampone liquido dal fondo nella corrispondente provetta vuota pre-etichettata.
Gettare la provetta usata contenente il tampone. Concentrare il campione in un concentratore a vuoto, assicurandosi che il tappo della provetta sia aperto, al termine del ciclo, assicurarsi che il campione sia completamente concentrato con solo un pellet rimasto. Conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.
Per l'analisi RT-QuIC, preparare una piastra di controllo negativa e positiva con i corrispondenti omogeneizzati cerebrali diluiti in una soluzione di diluizione tissutale. Ora scongelare il pellet di estratto del tampone conservato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e risospendere l'estratto di tampone essiccato con 50 microlitri di acqua di grado molecolare mediante pipettaggio. Agitare brevemente e lasciare riposare il campione a temperatura ambiente.
Caricare due microlitri di controlli negativi e positivi su piastra seguiti da estratti di tampone nei rispettivi pozzetti per piastre RT-QuIC. I tamponi di controllo negativi non hanno superato la soglia di fluorescenza positiva, confermando l'assenza di contaminazione durante le procedure. Gli estratti di tampone di controllo positivo hanno mostrato una semina coerente in tutti i pozzetti replicati, dimostrando un'adeguata sensibilità di rilevamento.
I campioni di tamponi superficiali provenienti da aree non contaminate non hanno mostrato una semina superiore alla soglia, confermando la negatività ai prioni. Superfici contaminate da prioni, hanno mostrato una semina al di sopra della soglia con rapporti massimi di punti e tempi di fluorescenza variabili rispetto ai controlli. Le superfici contaminate da prioni trattate con candeggina non sono riuscite a seminare RT-QuIC, dimostrando un'efficace disinfezione.
Alcuni artefatti superficiali mostravano curve cinetiche alterate e tempi di fluorescenza più lunghi, indicando potenziali falsi positivi, probabilmente dovuti alla presenza di polvere o sostanze chimiche residue su una superficie.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per valutare la contaminazione da prioni in ambienti di laboratorio e delinea un protocollo di decontaminazione efficace. Il test di spugna per la sicurezza dei prioni da laboratorio descritto è adattabile per soddisfare le esigenze specifiche di diversi laboratori.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia dei prioni
- Sicurezza in laboratorio
Sfondo
- I prioni sono proteine infettive che possono persistere nell'ambiente.
- I metodi attuali per valutare la contaminazione da prioni sono inadeguati.
- Comprendere le interazioni dei prioni con le superfici è cruciale per il controllo delle infezioni.
- Lo studio mira a sviluppare un metodo affidabile per rilevare le attività di seeding dei prioni.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo robusto per determinare l'efficacia dell'inattivazione dei prioni.
- Fornire un protocollo per l'assunzione di superfici per rilevare i prioni.
- Migliorare la sicurezza in laboratorio per quanto riguarda la contaminazione da prioni.
Metodi utilizzati
- Metodo di tamponamento combinato con RT-QuIC per il campionamento delle superfici.
- Preparazione di controlli positivi e negativi utilizzando omogeneizzati cerebrali.
- Sonicazione e centrifugazione per la preparazione dell'estratto del tampone.
- Analisi RT-QuIC per il rilevamento delle attività di seeding dei prioni.
Risultati principali
- I tamponi di controllo positivo hanno mostrato un seeding coerente, confermando la sensibilità di rilevamento.
- Le superfici non contaminate non hanno mostrato seeding di prioni.
- Le superfici contaminate da prioni hanno dimostrato un seeding sopra la soglia.
- Le superfici trattate con candeggina hanno eliminato efficacemente il seeding dei prioni.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per valutare la contaminazione da prioni.
- L'assunzione di superfici può rilevare in modo affidabile la presenza di prioni in varie ambienti.
- Procedure di decontaminazione adeguate possono ridurre significativamente i rischi di prioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Persistent prion contamination poses a unique biosafety and operational risk in neuroscience and biomanufacturing environments, threatening both occupational safety and experimental integrity. The prion safety laboratory swipe test, coupled with RT-QuIC analysis, enables objective assessment of decontamination efficacy and environmental monitoring. Integrating this workflow supports risk mitigation and cross-functional confidence in high-containment research and production settings.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables verification of prion inactivation to support safe handling of disease-relevant models.
- Reduces mechanistic ambiguity by confirming absence of residual prion seeding activity on laboratory surfaces.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays by minimizing contamination risk.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, contamination-free workspaces for sensitive prion amplification assays.
- Standardizes environmental monitoring with quantitative RT-QuIC readouts for reproducibility.
- Enables reliable evaluation of decontamination protocols prior to high-throughput screening or assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by ensuring biosafety in disease-relevant systems.
- Reduces risk of cross-contamination that could confound translational biomarker studies or preclinical endpoints.
- Provides mechanistic de-risking for studies involving persistent or surface-bound prion agents.
Pipeline & Workflow Integration
The swipe test and RT-QuIC workflow integrates at the interface of laboratory biosafety, assay development, and translational research, supporting both early discovery and preclinical validation phases.
- Discovery Biology: Confirms effective prion inactivation and supports hypothesis testing in prion biology.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for environmental assay readiness.
- Analytics: Delivers threshold-based RT-QuIC measurements to compare decontamination efficacy across conditions.
- Translational Research: Ensures continuity and biosafety in disease-relevant preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for ongoing laboratory and facility monitoring.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in prion research workflows.
- Operational Value: Standardizes biosafety monitoring and supports reproducibility across teams and sites.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for facility use and experimental design, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of prion-related research and development programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in prion biology and RT-QuIC assay operation.
- Needs access to molecular biology instrumentation, including sonicators and RT-QuIC platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization of sampling and control procedures.
- Must be adapted for different laboratory layouts and surface types as supported by the protocol.
- Potential for artifactual results due to surface contaminants necessitates careful interpretation of RT-QuIC kinetics.
