Somministrazione di anestetici volatili a larve di pesce zebra per l'osservazione comportamentale

La nostra ricerca si concentra sulla farmacologia dell'anestesia, che include un interesse per i meccanismi anestetici e i meccanismi degli effetti collaterali dell'anestetico. L'uso delle larve di pesce zebra come modello comportamentale per studiare la farmacologia anestetica è in rapida espansione e presenta molti vantaggi, tra cui la loro idoneità all'uso in esperimenti di screening su larga scala. Il confronto tra anestetici volatili ed endovenosi rimane impegnativo perché la somministrazione di anestetici volatili ad animali non acquatici è molto più semplice rispetto agli anestetici per via endovenosa.

Al contrario, gli anestetici per via endovenosa sono più facilmente somministrati agli animali acquatici rispetto agli anestetici volatili. Questo protocollo fornisce un mezzo relativamente economico e accessibile per somministrare anestetici volatili in una camera chiusa per eseguire esperimenti comportamentali nelle larve di pesce zebra. Altri protocolli di questa natura richiedono spesso una qualche forma di apparato personalizzato che può essere costoso o non facilmente accessibile a coloro che non hanno i mezzi per creare o acquisire questo tipo di apparecchiatura.

Per iniziare, stendi un foglio di silicone da 0,5 millimetri su una superficie piana e pulita. Ispeziona i fogli per eventuali pieghe ed evitale quando possibile. Pulisci le lenzuola con alcool al 70% per rimuovere olio o detriti.

Quando il foglio è completamente asciutto, utilizzare un applicatore come un pennello, per applicare uno strato sottile e uniforme di primer adesivo sul foglio di silicone. Una volta applicato il primer adesivo, allineare il nastro biadesivo con il foglio di silicone con il supporto di carta rivolto verso l'alto. Applicare gradualmente il nastro adesivo sul silicone utilizzando un rullo per levigare la superficie e rimuovere le bolle d'aria.

Riapplicare il primer in piccole sezioni secondo necessità e continuare l'applicazione del nastro adesivo mentre il primer si asciuga in uno o cinque secondi. Capovolgere il foglio di silicone per lavorare il silicone con il lato rivolto verso l'alto per facilitare la visualizzazione e la rimozione delle bolle d'aria. Quindi, tagliare il silicone adesivo in strisce larghe almeno 10 millimetri.

Assicurarsi che le strisce siano sufficientemente lunghe da coprire almeno la larghezza di una fila della piastra a pozzetti. Per preparare gli anestetici volatili, aggiungere un volume di solvente non volatile a una fiala HPLC o a scintillazione, garantendo uno spazio di testa minimo una volta aggiunta la diluizione finale dell'anestetico volatile. Utilizzare una siringa a tenuta di gas Hamilton per aggiungere l'anestetico volatile e sigillare rapidamente la fiala.

Mescolare le fiale mediante vortice o sonicazione secondo necessità. Conservali temporaneamente mentre prepari i piatti di zebrafish. Per impostare l'esperimento comportamentale, trasferire una larva di pesce zebra a cinque giorni dopo la fecondazione in ogni altra fila di una piastra di vetro a 96 pozzetti.

Rimuovere con cautela la soluzione E-3 da ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire ogni pozzetto della fila con la soluzione sperimentale. Utilizzando le strisce adesive in silicone, premere rapidamente la striscia verso il basso per evitare la formazione di bolle e la fuoriuscita dei pesci nei pozzetti adiacenti.

Quindi premere con decisione sulla parte superiore della piastra per assicurarsi che ogni pozzetto sia sigillato. Ripetere il processo di sigillatura fino a quando la soluzione non viene sostituita e tutti i pozzetti in ogni altra fila della piastra sono sigillati. Capovolgere delicatamente la piastra e verificare la presenza di bolle d'aria.

Posizionare la piastra nell'unità di osservazione del comportamento con l'adesivo siliconico rivolto verso il basso ed eseguire l'esperimento comportamentale. Nei pozzetti sigillati, la concentrazione di sevoflurano ha mostrato una perdita minima nell'arco di tre ore e l'isoflurano ha mostrato una diminuzione della concentrazione del 4%. Nessuno dei due anestetici ha mostrato perdite significative durante i primi 30-60 minuti.

La concentrazione efficace mediana per il sevoflurano era di 62 micromolari per il movimento spontaneo e di 126 micromolari per il movimento suscitato, con la scala notevolmente inferiore ai 240 micromolari precedentemente riportati, il che potrebbe essere dovuto al miglioramento nella creazione di una tenuta stagna con questo metodo. È stata osservata una differenza significativa nel movimento spontaneo tra pozzi aperti e sigillati, emersi al segno delle due ore, probabilmente a causa dell'esaurimento dell'ossigeno nel pozzo, ed è un'importante limitazione di questa tecnica.