Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Per i pazienti con diagnosi di tumori solidi della mammella o del pancreas, esiste una forte correlazione tra eventi di progressione della malattia, come metastasi o resistenza alla terapia, e scarsi risultati. È noto che i meccanismi molecolari cellulari che governano l'omeostasi e la fibrosi dei tessuti controllano anche la progressione dei tumori solidi. Il mio laboratorio è interessato a comprendere questi meccanismi in modo da poter sviluppare meglio terapie e misure diagnostiche per aiutare i pazienti.

Una delle principali sfide sperimentali è che c'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D in grado di catturare le interazioni intercellulari durante i processi fisiologici e fisiopatologici, e quindi, comprendendo queste interazioni, è possibile comprendere ulteriori informazioni sulle malattie per poi sviluppare nuove strategie di trattamento. Il nostro protocollo fornirà un metodo di coltura cellulare 3D economico e riproducibile che replica le caratteristiche del microambiente tissutale in vivo. Il nostro protocollo fornirà metodi di coltura cellulare 3D facili e rapidi, privi di scaffold e basati su scaffold, in cui possiamo quantificare interazioni cellulari eterogenee.

Abbiamo scoperto un modo per formulare in modo efficiente colture di sferoidi 3D che possono essere utilizzate con modelli privi di scaffold, ma possono anche essere fuse con sistemi basati su scaffold per misurare l'invasione e il comportamento cellulare. Per iniziare, accendi la luce ultravioletta per disinfettare l'interno dell'armadio di biosicurezza per 15 minuti. Aprire l'anta della finestra dell'armadio di biosicurezza per stabilizzare il flusso d'aria e accendere il sistema di aspirazione del vuoto.

Pulire la superficie interna della cappa e i tubi del sistema di aspirazione del vuoto con etanolo al 70%. Riscaldare il terreno di coltura cellulare, il PBS e lo 0,25% di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius in un bagno di perline. Ora, esamina le cellule al microscopio per confermare la confluenza dal 70 all'80%.

Utilizzando un aspiratore a vuoto, aspirare ed eliminare il terreno di coltura dalle cellule piastrate. Lavare il terreno rimanente una volta con due millilitri di PBS, quindi aspirare e scartare il PBS dopo il lavaggio. Successivamente, utilizzando una micropipetta, aggiungere un millilitro di tripsina al piatto di coltura cellulare e posizionare la piastra all'interno di un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Ora, aggiungi un millilitro di inibitore della tripsina di soia nella PBS alla piastra per inattivare la tripsina. Per disperdere i cluster cellulari, pipettare la miscela liquida utilizzando una micropipetta P-1000. Raccogliere la sospensione cellulare dal fondo della piastra e trasferirla in una provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare la provetta a 100 G per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante utilizzando l'aspiratore a vuoto. Lasciare che le sonde fluorescenti molecolari si riscaldino a temperatura ambiente per 15 minuti in un bagno di perle temperato a 37 gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta, risospendere le cellule in due millilitri delle rispettive soluzioni di coloranti per il tracciante delle cellule di lavoro.

Incubare le provette a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Dopo 30 minuti di incubazione, centrifugare le provette a 100 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare un aspiratore a vuoto per aspirare e scartare il surnatante.

Risospendere accuratamente il pellet in un millilitro di DMEM contenente FBS al 10% utilizzando una micropipetta. Ora, raccogli 10 microlitri della sospensione cellulare e trasferiscila in una microprovetta contenente un volume uguale di blu di tripano. Dopo aver mescolato le cellule, aggiungere 20 microlitri della soluzione di tripano cellulare a un vetrino della camera di conteggio delle cellule.

Inserire il vetrino in un contatore di celle automatizzato per determinare il numero di cella. Calcola il numero medio totale di cellule vive da due letture. Preparare le scorte di celle di lavoro per ogni tipo di cellula a una concentrazione di 6,67 volte 10 alla potenza di tre celle per millilitro, equivalenti a 2.000 cellule per 300 microlitri.

Utilizzando una micropipetta, trasferire il volume necessario per tre repliche tecniche più una extra in una microprovetta. Dopo aver miscelato accuratamente con una pipetta, trasferire 300 microlitri di campione in un pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti con fondo a forma di U con attacco ultra basso. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius.

Immagine della crescita e della morfologia degli sferoidi ogni 24 ore, fino a 96 ore, utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Accendere i dispositivi di imaging e l'incubatrice automatizzata. Crea un nuovo protocollo di imaging nel task manager del software di imaging per catturare la crescita di 48 ore di sferoidi BT-474 co-coltivati con fibroblasti BJ-5ta e cellule endoteliali EA.hy926 colorate rispettivamente con i coloranti cell tracker blu, arancione e rosso intenso.

Riempi un secchiello del ghiaccio con ghiaccio per mantenere fredda la soluzione di estratto della membrana del seminterrato e metti la soluzione sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare circa 170 microlitri di terreno dalla piastra di coltura. Procuratevi una lente d'ingrandimento e una mini scatola luminosa per osservare da vicino i piccoli sferoidi.

Posizionare la piastra sferoidale a 96 pozzetti sopra la scatola luminosa e posizionare la lente d'ingrandimento sopra la testa. Impostare una pipetta P-200 a 30 microlitri e raccogliere l'estratto della membrana basale per creare tre microgoccioline. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia piana e posizionare la pipetta verticalmente sopra lo sferoide.

Ora, rilascia la gocciolina senza toccare il fondo del pozzo. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, sovrapporre gli sferoidi con altri 50 microlitri della soluzione di estratto della membrana basale per pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto. A 72 ore dalla placcatura, le cellule MCF-10A, MCF-10Ca1H e BT-474 co-coltivate con EA.hy926 e THP-1 o con BJ5-ta e THP-1 hanno mostrato un aumento significativo dell'area sferoidale rispetto agli sferoidi epiteliali in monocoltura. Al contrario, le cellule MDA-MB-468 co-coltivate hanno mostrato una significativa diminuzione dell'area sferoidale rispetto alla monocoltura.

L'applicazione del colorante tracciatore cellulare alle cellule epiteliali tumorigeniche BT-474 e alle cellule stromali prima dell'insediamento degli sferoidi ha dimostrato che le cellule stromali, tra cui EA.hy926 e BJ-5ta, formavano le strutture in gemmazione sul perimetro degli sferoidi centrali BT-474. A 24 ore dalla placcatura, una membrana basale è stata sovrapposta a cellule epiteliali tumorigeniche BT-474 co-coltivate con cellule stromali, dimostrando la formazione di strutture invasive.