Imaging a super-risoluzione del biofilm di Proteus mirabilis mediante microscopia ad espansione

Questo articolo presenta un protocollo completo per PmbExM, una tecnica di microscopia ad espansione progettata specificamente per i biofilm di Proteus mirabilis . PmbExM utilizza un trattamento enzimatico graduale di campioni di biofilm per ottenere un'espansione isotropa di 4,3 volte, consentendo l'analisi a super-risoluzione dell'organizzazione spaziale delle strutture cellulari e subcellulari all'interno di queste comunità microbiche sessili.

Lo scopo della nostra ricerca è quello di fornire alla comunità scientifica un metodo di super risoluzione accessibile per studiare l'architettura, l'assemblaggio e le caratteristiche intercellulari del biofilm del proteus mirabilis oltre il limite refrattario.

La microscopia quantitativa dei biofilm è impegnativa a causa delle limitazioni imposte dalla risoluzione ottica. La microscopia ad espansione del biofilm Proteus mirabilis, o PmbExM, contribuirà a migliorare la descrizione e l'analisi morfologica e topologica di queste complesse comunità microbiche. Due dei principali vantaggi di PmbExM sono che, in primo luogo, consente la visualizzazione a super risoluzione dei biofilm del proteo mirabilis utilizzando microscopi convenzionali a rifrazione e, in secondo luogo, non si basa su complesse routine di elaborazione dei dati post-acquisizione.

Il nostro metodo facilita lo studio su scala nanometrica della struttura e dell'organizzazione del biofilm per i ricercatori che non hanno accesso ad apparecchiature specializzate a super risoluzione e con esperienza avanzata nell'elaborazione o nell'analisi delle immagini digitali.

PmbExM consentirà l'interrogazione dell'architettura, dell'assemblaggio, delle caratteristiche cellulari e intracellulari del biofilm del proteus mirabilis su scala nanometrica. Inoltre, la sua malleabilità supporta l'adattamento e la codifica per altre specie di biofilm.

[Narratore] Per iniziare, aggiungere 400 microlitri di acido metacrilico millimolare N-idrossisuccinimidil estere, o MA-NHS in PBS ai campioni di biofilm colorati, e incubarli a temperatura ambiente per un'ora con una leggera agitazione. Dopo un'ora, lavare delicatamente i campioni di biofilm colorati tre volte con 300 microlitri di PBS a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. Rimuovere il PBS e aggiungere 300 microlitri di soluzione monomerica ai campioni. Incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Per costruire le precamere di gelificazione, utilizzare un vetrino come base, quindi tagliare, disporre e attaccare due pezzi di nastro biadesivo piegato sul vetrino per fungere da distanziatori da 400 micrometri. Disporre le camere a umido per proteggere i campioni dall'essiccazione durante la polimerizzazione. Ora, preparare un volume madre fresco di soluzione gelificante mescolando la soluzione monomerica, il 10% di tetrametil etilendiammina, lo 0,5% di 4-idrossi-TEMPO e il 10% di persolfato di ammonio in un rapporto di 47 a 1 a 1 a 1. Subito dopo aver preparato la soluzione gelificante, rimuovere la soluzione monomerica dai campioni e sostituirla con 300 microlitri di soluzione gelificante. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Nel frattempo, rimuovere la copertura protettiva rimanente dalle strisce di nastro biadesivo disposte sui vetrini. Pipettare 40 microlitri di soluzione gelificante tra i distanziatori. Una volta completata l'incubazione del campione, utilizzare una pinzetta per sollevare ciascun vetrino di copertura contenente biofilm e posizionarlo sopra la goccia da 40 microlitri di soluzione gelificante sul vetrino. Orientare il vetrino coprioggetto in modo che il biofilm, sulla sua superficie, entri in contatto con la soluzione gelificante. Terminare la costruzione della camera di gelificazione premendo delicatamente il vetrino coprinte contenente biofilm con una pinzetta per garantire l'adesione ai distanziatori del nastro. Posizionare la camera di gelificazione assemblata all'interno di una camera bagnata per consentire la polimerizzazione e incubare a 37 gradi Celsius senza agitazione per due ore. Dopo due ore, smontare le camere di gelificazione e utilizzare una lama chirurgica per tagliare il gel in eccesso attorno alla regione di interesse del campione di biofilm. Posizionare i vetrini coprioggetto che trasportano i gel tagliati in una nuova piastra a 24 pozzetti con il lato del gel rivolto verso l'alto. Dopo la digestione enzimatica dei campioni gelificati con la soluzione di proteinasi K, rimuovere la soluzione di proteinasi e trasferire ciascun gel in una piastra di Petri separata da 60 millimetri per l'espansione dei campioni. Riempire ogni capsula di Petri con acqua deionizzata in eccesso in modo che il gel sia completamente immerso e incubare sotto leggera agitazione a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo aver completato il quinto scambio d'acqua, rimuovere l'acqua deionizzata che copre il gel. Utilizzare un piccolo pennello piatto per spingere delicatamente il campione su un vetrino di vetro da 24 x 50 millimetri. Rimuovere l'acqua in eccesso dal gel utilizzando carta velina. Posizionare con cautela il gel sulla superficie del vetro della camera di imaging, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria tra il gel e il vetro. Infine, aggiungere acqua deionizzata alla camera di imaging fino a quando il gel non è completamente sommerso. Sono state utilizzate analisi quantitative e spaziali per valutare la fedeltà all'espansione e la conservazione morfologica dei biofilm di proteus mirabilis dopo la microscopia di espansione del biofilm di proteus mirabilis o il trattamento PmbExM. La tecnica PmbExM ha ampliato le strutture del biofilm di circa 4,3 volte, mantenendo sia la morfologia cellulare che l'organizzazione topologica. Questa espansione ha aumentato significativamente la risoluzione visiva delle cellule batteriche, rendendo le singole strutture cellulari più nitide e definite. Grazie alla risoluzione migliorata, PmbExM ha anche permesso di identificare chiaramente le disposizioni batteriche multistrato all'interno del biofilm che in precedenza non erano state risolte. PmbExM ha anche facilitato la visualizzazione di strutture subcellulari precedentemente irrisolvibili, inclusi modelli distinti di organizzazione del DNA. Questi modelli organizzativi sono stati confermati dai profili di intensità della linea, che hanno rivelato picchi di fluorescenza multipli distinti nei campioni espansi rispetto al singolo picco osservato nelle cellule non espanse.