Studio della morte cellulare programmata indotta da nanoparticelle di rame nei batteri

Questa ricerca studia l'efficacia battericida nanopartitica del rame contro tre batteri comuni clinicamente significativi. Esplora casi tra cui la generazione di ROS e il potenziale coinvolgimento della morte cellulare programmata.

Una sfida attuale è quella di ottenere un numero costante di colonie. Credo che ciò derivi dall'intervento. La modernizzazione delle cellule durante la diluizione elimina il conteggio falso con la posizione rispetto al conteggio più esperto.

Il nostro gruppo è stato il primo a utilizzare un modulatore cellulare per studiare i meccanismi battericidi delle nanoparticelle di rame, rivelando che la morte batterica coinvolge processi cellulari come la generazione di ROS e l'autofagia.

Il protocollo affronta la necessità di una comprensione più profonda del meccanismo con cui le nanoparticelle di rame uccidono i batteri, concentrandosi in particolare sull'area inesplorata dei percorsi di morte cellulare programmata batterica.

Utilizzando diversi modulatori cellulari, abbiamo confermato che la morte batterica indotta da nanoparticelle di rame comporta autofagia e sovraccarico di ROS e identificato percorsi chiave supportati da esperimenti affidabili basati su triplicati con un semplice desig

[Narratore] Per iniziare, ottenere nanopolveri di rame commerciali con diametri di 25 nanometri e da 60 a 80 nanometri da un fornitore commerciale. Utilizzare un millilitro di SDS millimolare come disperdente per ogni dimensione di nanoparticelle. Quindi disperdere le nanoparticelle utilizzando un bagno ad ultrasuoni per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, procurati i ceppi di Escherichia coli, Acinetobacter baumannii e Staphylococcus aureus dai rispettivi centri di risorse biologiche. Coltiva ogni batterio in 10 millilitri di brodo LB in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius. Diluire le colture batteriche in terreno LB per raggiungere una densità ottica di circa 0,5 a 600 nanometri. Ora usa soluzioni di nanoparticelle di rame stock per preparare una gamma di concentrazioni comprese tra zero e 100 microgrammi per millilitro di entrambe le dimensioni. Pipettare 500 microlitri di colture batteriche in provette per microcentrifuga e centrifugare a 3.300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver pipettato il surnatante, aggiungere diverse concentrazioni di entrambe le dimensioni delle nanoparticelle a ciascuna provetta. Trattare i gruppi di controllo con 500 microlitri di PBS come controllo negativo e 500 microlitri di alcol al 70% come controllo positivo. Quindi incubare tutti i campioni con agitazione a 200 giri al minuto a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, lavare i batteri con PBS e distribuirli su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, contare le colonie su ogni piastra per tutti i gruppi di trattamento. Trattare i batteri con cinque micromolari SBI per due ore, 0,5 micromolari di necrosulfonamide per un'ora, 100 nanomolari di wortmannina per 30 minuti o 100 nanomolari Z-VAD per 30 minuti. Al termine di tutto il pretrattamento, centrifugare tutte le provette a 3.300 g per 10 minuti. Quindi risospendere il pellet in 800 microlitri di PBS per lavare il modulatore di pretrattamento. Distribuire i pellet risospesi. Centrifugare ogni provetta, quindi scartare il surnatante. Risospendere i pellet in miscele di modulatori di nanoparticelle prima di incubare con agitazione. Ora aggiungi il 70% di etanolo e PBS come controlli positivi e negativi. Includere gruppi di controllo in bianco trattati con inibitori, ma senza nanoparticelle. Dopo l'incubazione, pipettare il reagente di vitalità cellulare con un rapporto di volume da uno a dieci e incubare. Dopo aver centrifugato nuovamente le colture, trasferire i surnatanti in piastre a 96 pozzetti. Misura la fluorescenza a 560 nanometri di eccitazione e 590 nanometri di emissione utilizzando un lettore di micropiastre. Diluire i surnatanti rimanenti a 10 alla potenza di cinque negativo e 10 alla potenza di quattro negativi e distribuire su piastre di agar LB per la coltura. Conta le singole colonie il giorno seguente. Pipettare le colture batteriche in provette per microcentrifuga. Quindi esporre le colture a luce ultravioletta a 405 nanometri per tre ore. Quindi, incubare le colture a 45 gradi Celsius per due ore. Quindi incubare i batteri a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo il trattamento a freddo, incubare i batteri in perossido di idrogeno al 3% per 30 minuti. Mantenere un gruppo di controllo a 37 gradi Celsius in brodo LB. Ora tratta i batteri con particelle da 20 o 60 nanometri a concentrazioni comprese tra uno e 100 microgrammi per millilitro per 24 ore. Quindi lavare due volte i batteri trattati con PBS. Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet batterici in una soluzione a cinque micromolari di colorante diclorodiidrofluoresceina diacetato 2',7'. Analizza l'intensità della fluorescenza a 520 o 530 nanometri di emissione. La conta delle colonie di Escherichia coli è stata significativamente ridotta di nanoparticelle di rame a 20 nanometri a un microgrammo per millilitro e di nanoparticelle di rame a 60 nanometri a cinque microgrammi per millilitro. Lo Staphylococcus aureus ha mostrato riduzioni significative della conta delle colonie a tutte le concentrazioni di entrambe le dimensioni delle nanoparticelle. In Acinetobacter baumannii, le riduzioni del numero di colonie hanno richiesto cinque microgrammi per millilitro di nanoparticelle di rame a 20 nanometri e 10 microgrammi per millilitro di nanoparticelle di rame a 60 nanometri. I trattamenti con nanoparticelle di rame hanno indotto la produzione di specie reattive dell'ossigeno in tutti i batteri, con particelle a 20 nanometri che mostrano le più alte frazioni di cellule positive a concentrazioni più basse. Al contrario, i trattamenti con nanoparticelle di rame a 60 nanometri hanno portato a una generazione costante di specie reattive dell'ossigeno in tutte le concentrazioni. Il modulatore programmato della morte cellulare Z-VAD ha aumentato la sopravvivenza di Escherichia coli trattato con entrambe le dimensioni delle nanoparticelle a concentrazioni da basse a moderate. Il trattamento con NSA ha migliorato la sopravvivenza di Staphylococcus aureus in tutte le concentrazioni di nanoparticelle di rame a 20 nanometri. L'Acinetobacter baumannii ha mostrato una migliore vitalità con Z-VAD sotto uno, cinque e 10 microgrammi per millilitro di esposizione a particelle di rame sia a 20 che a 60 nanometri, mentre l'NSA ha aumentato la vitalità a soli 10 microgrammi per millilitro di esposizione a nanoparticelle di rame a 20 nanometri.