Deplezione rapida dei macrofagi renali utilizzando lo strumento di ablazione cellulare CD59/intermedisina umana

Utilizziamo l'oblazione mediata da intermedia della cellula umana che esprime CD59 nei topi per studiare la rigenerazione dei microfagi renali, concentrandoci sul recupero dei monociti guidato dalle chemochine e sulla creazione di una nicchia di sorveglianza immunitaria dopo l'infortunio. I recenti sviluppi nel nostro campo rivelano il meccanismo di rigenerazione dei macrofagi renali, evidenziando una chemochina specifica che recluta i macrofagi e come la sorveglianza immunitaria viene ristabilita dopo un danno renale acuto. Combiniamo la criogenetica inducibile dal tamoxifene, l'ablazione intermedia, la citometria a flusso multiparametrica e la microscopia intravitale per ablare, tracciare e visualizzare i macrofagi renali in tempo reale.

Le sfide principali sono evitare l'infiammazione sistemica, prendere di mira solo i macrofagi residenti e misurare la rapida rigenerazione senza disturbare il delicato ambiente micrometrico renale. Abbiamo dimostrato che i monociti ripristinano l'88% dei macrofagi renali entro sette giorni dall'ablazione, un processo che dipende in modo critico dagli assi di segnalazione CX3 CR1, CX3 CL1. Per iniziare, preriscalda l'olio di mais a 42 gradi Celsius.

Sciogliere 100 milligrammi di tamoxifene in cinque millilitri di olio di mais preriscaldato per preparare una soluzione madre con una concentrazione di 20 milligrammi per millilitro. Somministrare tamoxifene per via intraperitoneale a topi maschi di età compresa tra 10 e 12 settimane alla dose di 100 microgrammi per grammo di peso corporeo. Dopo 15 giorni, iniettare una singola dose endovenosa di intermedisina nei topi alla dose di 120 nanogrammi per grammo di peso corporeo.

Monitorare e confermare l'ablazione dei macrofagi residenti e la successiva rigenerazione eseguendo la citometria a flusso a uno, tre e sette giorni, dopo la somministrazione intermedia. Per la raccolta dei reni, utilizzare una pinza sottile e le forbici per praticare un'incisione orizzontale nella regione addominale inferiore di un topo soppresso. Estendi l'incisione verticalmente lungo la linea mediana fino a poco sotto la gabbia toracica o lo sterno.

Ritrarre delicatamente la pelle e il muscolo per scoprire la cavità toracica. Aprire l'atrio destro per consentire al sangue di defluire dalla circolazione. Inserire un ago da 21 a 23 gauge nel ventricolo sinistro.

Iniziare la perfusione con 10-20 millilitri di PBS freddo per eliminare il sangue. Continua la perfusione fino a quando i reni appaiono pallidi, indicando un'efficace eliminazione del sangue. Individua i reni contro la parete dorsale del corpo e separali delicatamente dai tessuti circostanti usando pinze e forbici.

Asportare le capsule renali e mettere immediatamente i reni in PBS freddo per prevenire la degradazione. Preparare 100 millilitri di cocktail di enzimi per la digestione mescolando HBSS, collagenasi IV e DNasi I privi di calcio e magnesio.Preparare la soluzione enzimatica fresca e tenerla in ghiaccio fino all'uso. Usando le forbici sterili, tritare i reni in piccoli frammenti in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di HBSS.

Trasferire il tessuto renale tritato in provette da 15 millilitri contenenti 10 millilitri della soluzione enzimatica preparata. Ora incubare le provette a 37 gradi Celsius per 30 minuti con una leggera agitazione per dissociare il tessuto. Triturare delicatamente il tessuto utilizzando una pipetta o uno stantuffo della siringa per rompere ulteriormente i grumi di cellule.

Rimuovere i detriti facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Centrifugare la sospensione cellulare a 700 G per 10 minuti a 18 gradi Celsius. Quindi, decantare accuratamente il tampone.

Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per lisare i globuli rossi. Aggiungere PBS per lavare le cellule e rimuovere il tampone di lisi. Mantenere la sospensione a cella singola risultante sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.

Per la centrifugazione in gradiente di densità, risospendere prima il pellet cellulare in 10 millilitri di soluzione con gradiente di densità al 30%. Sovrapporre con cura questo su tre millilitri di soluzione a gradiente di densità al 70% in una provetta da centrifuga. Centrifugare la sfumatura a 500 G per 30 minuti senza fare interruzione.

Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di interfaccia tra le soluzioni al 30% e al 70%. Lavare due volte le cellule raccolte con 10 millilitri di PBS e centrifugare ogni lavaggio a 500 G per 10 minuti. Risospendere il pellet finale della cella in un millilitro di tampone FACS in una provetta da 1,5 millilitri.

Conta le cellule usando un emocitometro al microscopio a campo chiaro e regola la concentrazione delle cellule a due volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro. Pellettare le celle in provette da 1,5 millilitri centrifugando a 650 G per cinque minuti e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone FACS. Aggiungere anticorpi anti CD 16 o 32 a una diluizione fino a 200 per bloccare il legame aspecifico del recettore FC.

Dopo aver incubato le cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius, colorare le cellule con colorante aqua vivo/morto e un cocktail di anticorpi preconiugati, tra cui CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE e F4/80 BV 605. Aggiungere il cocktail di anticorpi direttamente alla sospensione cellulare. Incubare il campione per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio per proteggere i fluorofori.

Quindi lavare le celle due volte con tampone FACS. Fissare le cellule in paraformaldeide all'1% per 30 minuti su ghiaccio. Quindi lavare le cellule due volte con tampone FACS per rimuovere il fissativo residuo.

Acquisire cellule colorate e fissate utilizzando un citometro a flusso. Analizza i dati utilizzando il software. Identificare i macrofagi e le microglia residenti nei reni e in altri tessuti utilizzando i marcatori CD45, CD11B e F4/80.

Eseguire il gating iniziale per selezionare le cellule vive utilizzando i profili di dispersione in avanti e lateralmente. Elimina i doppietti utilizzando l'area di dispersione in avanti rispetto al gating dell'altezza. Escludere le cellule morte utilizzando il colorante vitale.

Arricchire le cellule immunitarie controllando le popolazioni CD45 positive. Definire i macrofagi residenti nei reni come cellule CD11b+F4/80hi all'interno del gate CD45 positivo, come mostrato nella strategia di gating. Definire le popolazioni di microglia come cellule intermedie CD11b+CD45 ed eseguire l'analisi finale.

Una singola banda proteica prominente è stata osservata vicino a 54 kilodalton nel gel della pagina SDS, confermando la purezza e il peso molecolare atteso dell'intermedisina ricombinante. L'intermedilisina purificata ha mostrato una forte attività emolitica in modo dose-dipendente, raggiungendo una lisi dei globuli rossi del 50% a 7,24 nanogrammi per millilitro e una lisi quasi completa a 650 nanogrammi per millilitro. L'analisi della citometria a flusso ha confermato il successo e la deplezione selettiva dei macrofagi renali nei topi cre-R con composto CD59 umano inducibile un giorno dopo la somministrazione intermedia della sina, senza deplezione nei topi di controllo.

I macrofagi renali hanno iniziato a ripopolarsi entro il terzo giorno e si sono ripresi a circa l'88% della loro popolazione originale entro il settimo giorno. Solo il 5% dei macrofagi renali appena rigenerati esprimeva CD59 umano entro il settimo giorno, indicando che il ripopolamento avveniva principalmente attraverso il reclutamento di monociti piuttosto che la proliferazione in situ.