Saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster

La nostra ricerca utilizza strumenti optogenetici per studiare come i circuiti neurali in Drosophila melanogaster governano comportamenti, come la termotassi e la gestazione. Controllando neuroni specifici con la luce, miriamo a capire come questi circuiti guidano le risposte sensoriali e influenzano il processo decisionale con alta precisione. L'optogenetica è una tecnologia preziosa nelle neuroscienze, che offre un controllo preciso dell'attività neurale utilizzando la luce.

In Drosophila melanogaster, strumenti come CsChrimson e GtACR2 consentono l'attivazione e l'inibizione mirate dei neuroni. Questi strumenti consentono ai ricercatori di manipolare i circuiti neurali, studiare il comportamento ed esplorare le risposte dei sensori con elevata specificità. Il nostro protocollo offre un approccio semplice, economico e riproducibile alla manipolazione optogenetica in Drosophila.

Utilizza materiali disponibili in commercio, rendendolo accessibile in laboratori e aule con risorse limitate. I metodi sono anche altamente adattabili, consentendo lo studio di comportamenti attraenti e di evitamento con sfide tecniche minime. Per iniziare, ottieni mosche maschio e femmina di Drosophila, che esprimono GtACR2 nelle celle di riscaldamento.

Allineare due piastre di acciaio su piastre riscaldanti separate in modo che i loro bordi si incontrino. Posizionare una protezione in fogli di plastica sulla parte superiore e fissarla con del nastro adesivo per ridurre al minimo i movimenti. Ora, posiziona un pezzo di carta bianca sulla protezione del foglio per ridurre i segnali di rumore di fondo e posiziona una copertura di plastica trasparente sopra la carta bianca.

Quindi praticare un foro sul fondo di una scatola di polistirene espanso per ospitare la fotocamera e la luce blu a circa 12 centimetri sopra la superficie sperimentale. Posizionare la fotocamera e la luce blu per ridurre al minimo l'abbagliamento, garantendo al contempo l'attivazione. Imposta la fotocamera in modo che registri con un time-lapse di un secondo, un campo stretto e una risoluzione di 4.000 x 3.000 pixel.

Regolare le impostazioni della piastra riscaldante per mantenere una temperatura superficiale di 25 gradi Celsius più o meno e 31 gradi Celsius più o meno un grado Celsius sulle rispettive piastre d'acciaio. Monitorare le temperature delle piastre d'acciaio utilizzando una sonda di temperatura superficiale prima e dopo ogni prova. Quindi, posiziona il coperchio di plastica sulla piastra in acciaio a 25 gradi Celsius.

Ora, usando un aspiratore di mosche, rilascia delicatamente una singola mosca sotto il coperchio. Posiziona la scatola sopra l'area sperimentale per creare una luce fioca al di sotto dei 10 lux e lascia che la mosca si acclimati per un minuto. Dopo il periodo di acclimatazione, sollevare la scatola e regolare rapidamente il coperchio di plastica in modo che il centro del coperchio sia allineato con il bordo della piastra d'acciaio.

Avvia la prova, accendi la fotocamera e la luce blu a 20 kilolux. Cattura l'attività delle mosche per due minuti. Dopo due minuti, spegnere la fotocamera e accenderla.

Smaltire le mosche utilizzando l'aspiratore. Anestetizzare mosche maschi e femmine affamati che esprimono CsChrimson nei neuroni del recettore del sapore dolce sul ghiaccio. Applicare da sette a 10 piccoli punti di colla su un vetrino.

Posiziona una mosca con il lato ventrale rivolto verso l'alto su ogni punto di colla, assicurandoti che il torace e le ali entrino in contatto con la colla per ridurre al minimo il movimento. Aprire le ali a ventaglio su ciascun lato per aumentare la superficie adesiva. Metti i tovaglioli di carta bagnati in una scatola per l'umidità e trasferisci i vetrini nella scatola.

Dopo due ore di recupero, posizionare il vetrino sotto il microscopio. Usa una siringa per erogare una goccia d'acqua per saziare le mosche, prevenendo le estensioni della proboscide indotte dalla sete. Tieni premuto manualmente un puntatore laser rosso e illumina la proboscide o la testa di una singola mosca a 700 lux.

Osservare la risposta dell'estensione della proboscide attraverso il microscopio entro una finestra di 30 secondi. Dopo aver testato l'estensione della proboscide indotta dalla luce, esaminare la risposta al saccarosio al 4%. Espellere una goccia di saccarosio all'estremità dell'ago della siringa e avvicinarla alla proboscide del moscerino.

Per prima cosa, assembla il labirinto di mosche per l'esperimento. In condizioni di oscurità o scarsa illuminazione, posizionare 10 mosche maschi e 10 femmine che esprimono CsChrimson nel tubo di caricamento e collegarlo alla camera di contenimento. Inclinare l'elevatore e picchiettare delicatamente il tubo per spostare le mosche nella camera di contenimento.

Dopo aver trasferito le mosche nella camera di contenimento, utilizzare l'elevatore per abbassarle tra il tubo di carico e i fori del tubo di prova. Quindi rimuovere il tubo di caricamento. Posiziona il labirinto di mosche a circa 13 centimetri di distanza dalla fonte di luce rossa da 1.000 milliampere senza accendere la luce.

Abbassare l'elevatore fino a quando la camera di supporto non si allinea con i fori del tubo di prova, consentendo alle mosche di muoversi liberamente tra le provette avvolte in pellicola e quelle scoperte. Contemporaneamente, accendi la luce rossa a circa 40 kilolux per attivare CsChrimson. Lascia che le mosche scelgano tra il tubo esposto alla luce rossa e il tubo ombreggiato per un minuto.

Dopo un minuto, sollevare l'elevatore tra il tubo di carico e i fori del tubo di prova. Rimuovi le mosche da ogni tubo. Contali e registra i numeri.

Pulisci l'elevatore di mosche e il labirinto di mosche usando acqua distillata dopo ogni prova. Nel test di preferenza posizionale, optogenetico, termotattico, con luce blu, i moscerini hanno evitato il lato a 31 gradi Celsius nelle condizioni di controllo, mentre nella luce blu con integrazione di ATR, i moscerini non hanno mostrato alcuna preferenza tra 25 e 31 gradi Celsius, indicando l'inibizione dei neuroni HC tramite l'attivazione di GtACR2. In condizioni di controllo, i moscerini hanno mostrato una risposta minima all'estensione della proboscide, mentre l'attivazione della luce rossa con l'integrazione di ATR ha provocato un'estensione significativa della proboscide, dimostrando l'attivazione dei neuroni sensibili al dolce da parte di CsChrimson.

Nel test optogenetico del labirinto di mosche a luci rosse, i gruppi di controllo non hanno mostrato alcuna preferenza, mentre l'attivazione della luce rossa con l'integrazione di ATR ha indotto i moscerini a evitare il tubo scoperto, indicando l'attivazione dei neuroni sensibili all'amaro da parte di CsChrimson.