Name: Saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Scopri la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster per studiare comportamenti termotattici e gustativi. Questo metodo riproducibile utilizza CsChrimson e GtACR2 per attivare o inibire neuroni specifici con precisione.

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1. Ceppi, allevamento di mosche e aspiratore di mosche
<ol>
	<li>Stiramenti e manutenzione<ol>
		<li>I ceppi utilizzati negli esperimenti includono HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte posteriore vola a 25 °C su un mezzo di farina di mais standard con un ciclo di luce di 12 ore:12 ore di buio. NOTA: 1 L di terreno di farina di mais contiene 1 L dH2O, 79 g di destrosio, 7,5 g di agar, 24 g di lievito in fiocchi, 57 g di farina di mais, 2,1 g di metil-4-idrossibenzoato (disciolto in 11,1 mL di etanolo), 6 g di tartrato di sodio e potassio tetraidrato e 0,9 g di cloruro di calcio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Allevamento di mosche e preparazione sperimentale<ol>
		<li>Smistamento delle mosche da 0 a 3 giorni. Al momento della sperimentazione, le mosche avranno un'età compresa tra 3 e 6 giorni, garantendo la coerenza legata all'età (Figura 1A).</li>
		<li>Dividi ogni genotipo in quattro gruppi 3 giorni prima di condurre gli esperimenti: ATR con luce da stanza -, ATR con luce da stanza +, ATR con luce rossa o blu -, e ATR con luce rossa o blu +.</li>
		<li>Preparare 80 mM di soluzione madre ATR sciogliendo ATR in etanolo al 100%. Integrare il cibo con 400 μM di ATR ai gruppi ATR+.</li>
		<li>Integrare il cibo con la stessa concentrazione di etanolo ma senza ATR ai gruppi ATR.</li>
		<li>Retrocedere tutti i gruppi al buio22.</li>
		<li>Starve Gr5a&gt;CsChrimson vola per 16-24 ore in fiale contenenti solo tessuto umido. I flaconcini ATR + contengono 400 μM di ATR miscelati con acqua, mentre i flaconcini ATR - contengono dH2O miscelati con la stessa concentrazione di etanolo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aspiratore di mosche<ol>
		<li>Assemblare l'aspiratore di mosche (Figura 1B) utilizzando un tubo di plastica, una rete per insetti e due pipette di trasferimento da 3 ml.</li>
		<li>Tagliare i puntali e i bulbi delle pipette di trasferimento, assicurandosi che il puntale di aspirazione della mosca consenta un comodo passaggio di una mosca. Questo design consente un'aspirazione delicata delle mosche attraverso l'inalazione, riducendo al minimo i danni e facilitando la raccolta e il trasferimento efficienti delle singole mosche.</li>
		<li>Stendere la rete anti-insetti sul tubo di plastica e fissare le estremità del bulbo della pipetta al tubo utilizzando Parafilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Saggio optogenetico di preferenza posizionale termotattica termotattica optogenetica a mosca singola
<ol>
	<li>Ceppi di Drosophila e allevamento di mosche<ol>
		<li>Incrocia la linea di driver HC-Gal410 con UAS-GtACR23, ottenendo il genotipo sperimentale HC&gt;GtACR2. I moscerini HC&gt;GtACR2 esprimono GtACR2 nelle celle riscaldanti. NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato un numero uguale di mosche maschi e femmine per ogni condizione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazione ed esecuzione del saggio sperimentale<ol>
		<li>Allineare due piastre di acciaio su piastre riscaldanti separate in modo che i loro bordi si incontrino. Posiziona una protezione per fogli di plastica sopra, fissandola con del nastro adesivo per ridurre al minimo i movimenti. Posizionare un foglio di carta bianca sulla protezione del foglio per ridurre i segnali di rumore di fondo (Figura 1C). NOTA: Sostituire la carta bianca all'inizio di ogni esperimento o quando è sporca.</li>
		<li>Posizionare un coperchio di plastica trasparente (2 mm di altezza × 58 mm di larghezza × 83 mm di lunghezza) sopra la carta bianca. Questa copertura consente alla mosca di camminare liberamente impedendole di volare.</li>
		<li>Praticare un foro sul fondo di una scatola di polistirene espanso (27 cm di altezza × 22 cm di larghezza × 16 cm di lunghezza) in modo che aderisca alla telecamera e alla luce blu (1.000 mA) a circa 12 cm sopra la superficie sperimentale.</li>
		<li>Posizionare la fotocamera e la luce blu per ridurre al minimo l'abbagliamento e abilitare l'attivazione. NOTA: Potrebbe essere necessario un pretest per determinare il raggio di attivazione della luce blu.</li>
		<li>Impostare la fotocamera per la registrazione con le seguenti impostazioni: timelapse di 1 s, campo stretto, 4000 × 3000 pixel.</li>
		<li>Regolare le impostazioni della piastra riscaldante per mantenere una temperatura superficiale di 25 ± 1 °C e 31 ± 1 °C sulle rispettive piastre in acciaio. NOTA: Per le condizioni che richiedono temperature inferiori a 25 °C, sono necessari metodi di raffreddamento alternativi, come i dispositivi Peltier o il ghiaccio. Se le temperature delle piastre di acciaio superano i livelli desiderati, spruzzare la superficie con acqua distillata per raggiungere e mantenere le condizioni richieste. Quindi, usa un tovagliolo per assorbire l'umidità in eccesso dalla protezione del foglio di plastica.</li>
		<li>Prima e dopo ogni prova, monitorare le temperature utilizzando una sonda di temperatura superficiale. NOTA: Un controllo preciso della temperatura è fondamentale, poiché le fluttuazioni possono influire sui risultati.</li>
		<li>Posizionare il coperchio di plastica sul lato a 25 °C. Utilizzando un aspiratore di mosche, rilasciare delicatamente una singola mosca sotto il coperchio. Posiziona la scatola sopra l'area sperimentale per creare una luce fioca (&lt;10 lux) e lascia che la mosca si acclimati per 1 minuto.</li>
		<li>Trascorso il periodo di acclimatazione, sollevare la scatola e regolare rapidamente il coperchio in plastica, posizionandolo con il centro del coperchio allineato con il bordo della piastra in acciaio per garantire una copertura uniforme dei lati a 25 °C e 31 °C. NOTA: Durante questo processo, la temperatura dell'aria e la temperatura all'interno del coperchio sul lato a 31 °C aumentano a circa 27 °C entro 5 s (Figura supplementare 1), sufficienti per attivare le celle di riscaldamento11.</li>
		<li>Avvia la prova accendendo la fotocamera e la luce blu (20 kLux). NOTA: Non accendere la luce blu in condizioni di luce ambientale. Accendi la fotocamera e registra alcuni fotogrammi prima di accendere la luce blu in caso di movimento.</li>
		<li>Dopo più di 2 minuti, terminare la prova spegnendo la fotocamera e la luce. Smaltire le mosche utilizzando l'aspiratore. NOTA: Registrare alcuni fotogrammi in più in caso di movimento quando si spegne la fotocamera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi comportamentale e statistica<ol>
		<li>All'inizio della prova, analizza solo i dati delle mosche che rimangono sul lato dei 25 °C. NOTA: Scartare i dati dei moscerini che iniziano le prove sul lato a 31 °C, che spesso mostrano preferenze alterate23. Scartare le prove che coinvolgono mosche che non si avvicinano al bordo del lato di 31 °C, assicurandosi che abbiano fatto una scelta tra le temperature. Scartare i dati dalle mosche che rimangono ferme per oltre 30 s.</li>
		<li>Analizzare i risultati utilizzando le procedure descritte in precedenza23. Calcola l'indice di preferenza (PI) come il rapporto tra la differenza di tempo che la mosca ha trascorso in ciascuna zona di temperatura e il tempo totale, come mostrato nella seguente formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: I dettagli statistici per gli esperimenti sono forniti nelle legende delle figure. L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando un software di analisi dei dati appropriato.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Saggio di preferenza posizionale optogenetica a luce rossa a mosca singola
<ol>
	<li>Ceppi di Drosophila e allevamento di mosche<ol>
		<li>Incrocia la linea del driver Gr66a-Gal421 con UAS-CsChrimson2, ottenendo il genotipo sperimentale Gr66a&gt;CsChrimson. Le mosche Gr66a&gt;CsChrimson esprimono CsChrimson nei neuroni del gusto amaro. NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato un numero uguale di mosche maschi e femmine per ogni condizione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazione ed esecuzione del saggio sperimentale<ol>
		<li>Condurre il test in una stanza buia o in un ambiente buio per garantire un'attivazione controllata di CsChrimson (Figura 1D).</li>
		<li>Posizionare una videocamera a circa 45 cm sopra la superficie sperimentale.<ol>
			<li>Utilizzare una videocamera senza filtro a infrarossi. Se una videocamera è dotata di un filtro interno a infrarossi passa-corto che blocca lunghezze d'onda superiori a 700 nm, rimuoverlo.</li>
			<li>Far aderire un filtro passa-lungo da 830 nm sull'obiettivo utilizzando la super colla per catturare le lunghezze d'onda dell'infrarosso. Questa regolazione è essenziale per registrare il movimento della mosca in condizioni di luce infrarossa.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Posizionare una sorgente di luce rossa24 a circa 45 cm sopra la superficie sperimentale, garantendo un'intensità luminosa di circa 2,5 kLux (1.000 mA). NOTA: Si consiglia un'adeguata protezione per gli occhi in grado di filtrare il laser/la luce rossa. Gli occhiali di sicurezza laser aiutano a prevenire potenziali danni agli occhi dovuti all'esposizione diretta a un'intensa luce rossa.</li>
		<li>Usa una luce a infrarossi per visualizzare le mosche all'interno della configurazione. Tienilo acceso per tutta la durata dell'esperimento. NOTA: Evitare l'abbagliamento nell'area sperimentale causato dalla luce infrarossa; L'abbagliamento può complicare l'analisi dei dati.</li>
		<li>Utilizzare la colla per collegare un filtro passa-lungo a infrarossi da 780 nm a metà del coperchio di plastica. NOTA: Utilizzare qualsiasi filtro passa-lungo che blocchi le lunghezze d'onda inferiori a 780 nm. Il lato non filtrato consente il passaggio della luce rossa e degli infrarossi, mentre il lato filtrato consente il passaggio solo della luce infrarossa.</li>
		<li>Posiziona un materiale nero opaco sotto l'area sperimentale per ridurre al minimo il rumore di fondo.</li>
		<li>Posizionare una singola mosca sotto una copertura di plastica trasparente (2 mm di altezza × 58 mm di larghezza × 83 mm di lunghezza) utilizzando un aspiratore a mosca e lasciarla acclimatare per 1 minuto.</li>
		<li>Attendi che la mosca sia visibile sul lato non filtrato. Inizia la prova accendendo la videocamera e la luce rossa. NOTA: La videocamera è soggetta a movimenti subito dopo l'avvio. Fissare accuratamente la fotocamera durante la registrazione e accenderla alcuni secondi prima della registrazione per evitare movimenti aberranti che potrebbero complicare l'analisi. Non accendere la luce rossa fino all'inizio della prova.</li>
		<li>Registra il movimento della mosca per 1 minuto. NOTA: Scartare le prove in cui la mosca non si avvicina alla linea mediana o non si muove per più di 15 s.</li>
		<li>Dopo 1 minuto, terminare la prova spegnendo la videocamera e la luce. Smaltire le mosche utilizzando l'aspiratore. NOTA: Registrare alcuni fotogrammi in più per evitare gli effetti del movimento quando si spegne la fotocamera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi comportamentale e statistica<ol>
		<li>Analizzare i risultati utilizzando le procedure descritte in precedenza23. Calcola l'indice di preferenza (PI) come il rapporto tra la differenza tra il tempo trascorso dalla mosca nell'area senza filtro e l'area con il filtro e il tempo totale, come mostrato nella seguente formula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq02.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: I dettagli statistici per gli esperimenti sono forniti nelle legende delle figure. L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando un software di analisi dei dati appropriato.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Risposta all'estensione della proboscide optogenetica a luci rosse
<ol>
	<li>Ceppi di Drosophila e allevamento di mosche<ol>
		<li>Incrocia la linea del driver Gr5a-Gal420 con UAS-CsChrimson2, ottenendo il genotipo sperimentale denominato Gr5a&gt;CsChrimson. Le mosche Gr5a&gt;CsChrimson esprimono CsChrimson nei neuroni del recettore del gusto dolce. NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato un numero uguale di mosche maschi e femmine per ogni condizione.</li>
		<li>Affamare le mosche per 16-24 ore con ATR (ATR +) o senza (ATR -) prima del test. NOTA: Potrebbero essere necessari periodi di fame più lunghi per suscitare una risposta forte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazione ed esecuzione del saggio sperimentale<ol>
		<li>Anestetizzare le mosche raffreddandole sul ghiaccio (Figura 1E). NOTA: Evitare il contatto diretto tra mosche e ghiaccio. Limitare il tempo di raffreddamento a circa 1 minuto; Il raffreddamento prolungato può causare problemi di recupero e mortalità.</li>
		<li>Utilizzare la punta di una punta per pipetta da 1000 μl per applicare 7-10 piccoli punti di colla sui vetrini. NOTA: Piccole gocce di colla sul vetrino assicurano che la mosca non venga sommersa e aiutano a evitare che la colla si attacchi alla proboscide o alle zampe.</li>
		<li>Posiziona una mosca, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, su ogni punto di colla. Assicurarsi che il torace e le ali entrino in contatto con la colla per ridurre al minimo il movimento. Aprire le ali a ventaglio su ciascun lato per aumentare la superficie adesiva. NOTA: Evitare di posizionare le mosche troppo vicine tra loro, che potrebbero inavvertitamente attivare più mosche durante l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Lasciare asciugare la colla per circa 10 minuti.</li>
		<li>Trasferire i vetrini in una scatola per l'umidità (una scatola di plastica con tovaglioli di carta bagnati) e lasciare che le mosche si riprendano per 2 ore.</li>
		<li>Posizionare il vetrino sotto il microscopio. Usa una siringa per erogare una goccia d'acqua per saziare le mosche, prevenendo le estensioni della proboscide indotte dalla sete.</li>
		<li>Tenere premuto manualmente un puntatore laser rosso per emettere luce rossa sulla proboscide/testa di una singola mosca (700 lux) mentre si osserva la risposta PER attraverso il microscopio. NOTA: Una protezione per gli occhi in grado di filtrare il laser/luce rossa è essenziale quando si osserva la luce rossa attraverso il microscopio.</li>
		<li>Osserva e registra l'estensione della proboscide entro una finestra di 30 secondi. Segna ogni mosca utilizzando il seguente sistema di registrazione: 0 indica nessuna estensione, 0,5 indica 1-2 s di estensione, 1 indica che l'estensione dura oltre 3 s.</li>
		<li>Dopo aver testato l'estensione della proboscide indotta dalla luce, esaminare la risposta al saccarosio al 4% utilizzando una siringa. Espellere una gocciolina di saccarosio all'estremità dell'ago e avvicinarla alla proboscide della mosca. NOTA: Scartare i dati dei moscerini che non rispondono alla gocciolina di saccarosio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi comportamentale e statistica<ol>
		<li>Eseguire analisi statistiche utilizzando un software di analisi dei dati appropriato. NOTA: I dettagli statistici per gli esperimenti sono forniti nelle legende delle figure.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Saggio optogenetico del labirinto di mosche a luci rosse
<ol>
	<li>Ceppi di Drosophila e allevamento di mosche<ol>
		<li>Incrocia la linea del driver Gr66a-Gal421 con UAS-CsChrimson2, ottenendo il genotipo sperimentale Gr66a&gt;CsChrimson. Le mosche Gr66a&gt;CsChrimson esprimono CsChrimson nei neuroni del gusto amaro. NOTA: Assicurati che ogni gruppo contenga un numero uguale di mosche maschi e femmine.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Assemblaggio del labirinto di mosche<ol>
		<li>Crea il labirinto di mosche come mostrato nella Figura 1F. NOTA: In alternativa, stampare in 3D i componenti del labirinto di mosche, assemblandoli come precedentemente descritto25.</li>
		<li>Tagliare tre provette di coltura in plastica da 5 mL alla lunghezza corretta per ottenere una provetta di caricamento, una provetta trasparente scoperta e una provetta ricoperta di alluminio. Fissare i tubi al labirinto di mosche come mostrato nella Figura 1F.<ol>
			<li>A seconda del materiale del labirinto, tagliare i tubi di prova per garantire la stessa distanza per ogni condizione di prova. In base alla lunghezza della camera di contenimento, accorciare la provetta scoperta in un labirinto trasparente, accorciando la provetta ricoperta di pellicola se il labirinto è opaco.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazione ed esecuzione del saggio sperimentale<ol>
		<li>In condizioni di oscurità o scarsa illuminazione, posizionare 10 maschi e 10 femmine nel tubo di caricamento. Collegare il tubo di caricamento alla camera di supporto. Inclinare l'elevatore e picchiettare delicatamente il tubo per spostare le mosche nella camera di contenimento. NOTA: Abbassare l'elevatore in modo che solo metà della camera di contenimento sia aperta. Questa manipolazione facilita il trasferimento delle mosche dal tubo di carico alla camera di contenimento.</li>
		<li>Dopo che le mosche sono state trasferite nella camera di contenimento, utilizzare l'elevatore per abbassare le mosche tra il tubo di caricamento e i fori del tubo di prova. Quindi, rimuovere il tubo di caricamento.</li>
		<li>Posizionare il labirinto di mosche a circa 13 cm di distanza dalla fonte di luce rossa (1000 mA) senza accendere la luce.</li>
		<li>Abbassare l'elevatore fino a quando la camera di supporto non si allinea con i fori del tubo di prova, consentendo alle mosche di muoversi liberamente tra le provette avvolte nella pellicola e quelle scoperte. Contemporaneamente, accendi la luce rossa per attivare CsChrimson. Assicurarsi che l'intensità della luce rossa sulla superficie della provetta scoperta sia di circa 40 kLux. NOTA: Non accendere la luce rossa finché la camera di supporto non è abbassata e allineata con i fori della provetta. Si consiglia un'adeguata protezione per gli occhi in grado di filtrare il laser/luce rossa a causa dell'intensa luminosità della luce rossa.</li>
		<li>Le mosche scelgono tra il tubo esposto alla luce rossa e il tubo ombreggiato per un minuto.</li>
		<li>Dopo 1 minuto, sollevare l'elevatore tra il tubo di carico e i fori del tubo di prova. Conta le mosche in ogni tubo. NOTA: Vengono conteggiate solo le mosche attive e non ferite.</li>
		<li>Pulisci l'elevatore e il labirinto di mosche usando dH2O dopo ogni prova.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi dei dati e statistiche<ol>
		<li>Calcola l'indice di preferenza (PI) come il rapporto tra la differenza nel numero di mosche tra i tubi scoperti e coperti e il numero totale di mosche, come mostrato nella seguente formula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq03.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: I dettagli statistici per gli esperimenti sono forniti nelle legende delle figure. L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando un software di analisi dei dati appropriato</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Driver LED da 1000 mA</td><td>Luxeon Star</td><td>3021-D-E-1000</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura VWR da 5 mL, plastica, con tappi a doppia posizione VWR</td><td></td><td>60818-664</td><td></td></tr><tr><td>780 Filtro passa-lungo / IR 780 nm 100 mm x 100 mm</td><td>Filtri Lee</td><td>BH #LE8744</td><td>Tagliato a circa 47 x 100 si adatta alla copertura in plastica</td></tr><tr><td>Agfabric 6,5 piedi x 15 piedi Rete per insetti Rete da giardino per proteggere piante Verdure Fiori Frutta</td><td>The Home Depot</td><td>EIBNW6515</td><td></td></tr><tr><td>tutta la piastra in alluminio trans retinica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td></td></tr><tr><td>(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)</td><td>Amazon</td><td></td><td>acquistata da Amazon</td></tr><tr><td>Scatola di plastica nera</td><td>LI-COR</td><td>929-97101</td><td></td></tr><tr><td>CLORURO DI CALCIO ANHYDRO 25GR</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AC297150250</tr><tr><td>CX405 Handycam con sensore CMOS Exmor R</td><td>SONY</td><td>HDR-CX405</td><td></td></tr><tr><td>Elmer' s &ldquo; Colla scolastica"</td>Alcool etilico <td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, puro (200 Proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Agitatore con piastra riscaldante</td><td>Isotemp Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Fly: Gr5a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57592</td><td></td></tr><tr><td>Flyline: Gr66a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Flyline: HC-Gal4 (II)</td><td>Dr. Marco Gallio Lab</td><td></td><td>Un regalo gentile</td></tr><tr><td>Linea di mosca: UAS-CsChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55136</td><td></td></tr><tr><td>Linea di mosca: UAS-GtACR2/TM6B</td><td>Dr. Quentin Gaudry Lab</td><td></td><td>Un regalo gentile</td></tr><tr><td>Flystuff 62-101 Farina di mais gialla (11,3 Kg), Giallo, 11,3 Kg/unità</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 62-107 Lievito secco inattivo, 10 kg, fiocco nutrizionale, 10 kg/unità</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11,02 libbre)/unità</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>FreeMascot OD 8+ 190 nm&ndash; 420 nm / 600 nm&ndash; Occhiali di sicurezza laser viola/rosso/infrarossi con lunghezza d'onda di 1100 nm&nbsp;</td><td>FreeMascot&nbsp;</td><td>B08LGMQ65S</td><td>acquistato da Amazon</td></tr><tr><td>GoPro Hero8 Black</td><td>GoPro</td><td>6365359</td><td></td></tr><tr><td>filtri LEE 100 volte Filtro in poliestere a infrarossi #87 da 100 mm</td><td>B& H Photo</td><td>LE8744</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-lungo, vetro colorato, 50,8 x 50,8 mm, 830 nm Cut-on, RG830</td><td>Newport</td><td>FSQ-RG830</td><td></td></tr><tr><td>Metil 4-idrossibenzoato, 99%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>126960025</tr><tr><td>Mini vassoio MicroWell 60 pozzetti, basso profilo NS PS</td><td>Thermal Scientific&nbsp;</td><td>NUNC 439225</td><td>I coperchi sono utilizzati come "copertura in plastica"</td></tr><tr><td>Olympus Plastics 24-160RS, 1000 &micro; L Punte ergonomiche per pipette Olympus a bassa legatura, rack, sterili, 8 rack da 96 punte/unità</td><td>Eppendorf</td><td>24-160RS</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Pellicola sigillante</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>4 pollici x 125 piedi</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, ACS, 99,0-100,5%,&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>Software di</td></tr><tr><td>analisi dati</td>AA1159530<td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>versione 9</td></tr><tr><td>Pipette a trasferimento graduato Samco</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>225</td> Vetrini <td>da 3 mL</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>&nbsp; Stereomicroscopio 5 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS</td><td>CZ61</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di polistirolo (27 cm di altezza e 22 cm di larghezza e 16 cm di lunghezza)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>225911</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di temperatura superficiale</td><td>Fluke</td><td>80PK-3A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Integra</td><td>305270</td><td></td></tr><tr><td>Tate & Lyle 457 Destrosio, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Destrosio, Tate & Lyle, polvere, 50 libbre/unità</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-113</td><td></td></tr><tr><td>Termometro a termocoppia a grandi cifre calibrato tracciabile</td><td>Tracciabile da cple-parmer</td><td>&nbsp; UX-91210-07</td><td>Fisherbrand Termometro tracciabile BigDigit tipo K Triplo</td></tr><tr><td>LED blu di dritta</td><td>LEDSupply</td><td>07007-PB000-D</td><td>470 nm</td></tr><tr><td>Triplo LED rosso di drittaSuppply</td><td></td><td>07007-PD000-F</td><td>627 nm</td></tr><tr><td>Tygon PVC Tubo trasparente 1/4" ID, 3/8" OD, 5 piedi.</td><td>Azienda di forniture McMaster Carr</td><td>6516T21&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Univivi IR Illuminator, 850nm 12 LED Illuminatore IR grandangolare per visione notturna</td><td>Univivi</td><td>4331910725</td><td></td></tr><tr><td>Wakefield Thermal 25.4 mm Rotondo Dissipatore di calore Star LED Board - 882-100AB</td><td>Wakefield-Vette</td><td>882-100AB</td><td></td></tr><tr><td>Wireless Presenter</td><td>DinoFire Store</td><td>B01410YNAM</td><td>acquistato da Amazon</td></tr></tbody></table>

saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in drosophila melanogaster

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Saggio di preferenza posizionale termotattica termotattica optogenetica a luce blu a mosca singola Sono state testate quattro condizioni: luce della stanza senza integrazione di ATR (luce della stanza, ATR -), luce della stanza con integrazione di ATR (luce della stanza, ATR+), luce blu senza integrazione di ATR (blu, ATR -) e luce blu con integrazione di ATR (blu, ATR+). Le prime tre condizioni servivano da controlli. Negli esperimenti di controllo, le mosche hanno evitato il lato a 31 °C. Nella luce...

Saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

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Neuroscience

Neuroscienze

L'optogenetica consente l'uso della luce per manipolare neuroni geneticamente modificati per esprimere opsine specifiche, proteine sensibili alla luce la cui attivazione della luce innesca un cambiamento nello stato del neurone. Qui descriviamo un approccio optogenetico in Drosophila utilizzando l'opsina Channelrhodopsin2. Il protocollo di esempio presenta un set di test di optogenetica per studiare i circuiti neuronali dietro il comportamento di fuga della mosca.

drosofila Optogenetica: un metodo per manipolare i circuiti neuronali

Questo video dimostra uno studio del comportamento di navigazione delle larve di Drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni sensoriali olfattivi (ORN). Le larve transgeniche di Drosophila che esprimono canali ionici sensibili alla luce negli ORN sono poste su agarosio all'interno di un'arena comportamentale. La stimolazione optogenetica con la luce apre i canali, provocando un afflusso di cationi che innesca la trasmissione del segnale al cervello, e il comportamento di...

Comportamento di navigazione delle larve di Drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni sensoriali olfattivi

Strumenti optogenetic geneticamente codificati consentono la manipolazione non invasiva dei neuroni specifici...

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in...

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Descriviamo qui un metodo di configurazione comportamentale e di analisi dei dati per analizzare le risposte olfattive di un massimo di 100 mosche dell'aceto (Drosophila melanogaster). Questo sistema può essere utilizzato con stimoli olfattivi singoli o multipli e può essere adattato per l'attivazione optogenetica o il silenziamento di sottogruppi neuronali.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

Il presente protocollo descrive la generazione di Drosophila melanogaster che esprime le opsine eNpHR2.0 o ReaChR nel cuore per l'imaging OCT e la stimolazione cardiaca optogenetica. Sono riportate istruzioni dettagliate per l'imaging OCT di Drosophila e la modulazione del battito cardiaco, compresa la simulazione di arresto cardiaco ripristinabile, bradicardia e tachicardia in animali vivi in diversi stadi di sviluppo.

Sviluppo di modelli di Drosophila melanogaster per l'imaging e il controllo optogenetico della funzione cardiaca

Il protocollo presenta un metodo ad alto rendimento ed economico per valutare la neurotossicità nel moscerino della frutta attraverso la quantificazione della disfunzione locomotoria come alternativa ai modelli tradizionali di mammifero. Mira a valutare gli effetti neurotossici di composti farmaceutici, agenti ambientali o modificazioni genetiche utilizzando un modello sensibile, riproducibile ed eticamente favorevole.

Analisi comportamentale della disfunzione locomotoria in Drosophila melanogaster come lettura della neurotossicità

Scopri la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster per studiare comportamenti termotattici e gustativi. Questo metodo riproducibile utilizza CsChrimson e GtACR2 per attivare o inibire neuroni specifici con precisione.

Saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster

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