Name: Un modello in vitro della vescica di infezione del tratto urinario associata al catetere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Scopri un modello in vitro della vescica per studiare le infezioni del tratto urinario associate al catetere. Questo metodo permette di valutare l'efficacia di trattamenti antimicrobici contro i biofilm batterici.

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<table><tbody><tr><td>Prolunga della testa della pompa a carico rapido 313 Pompa</td> peristaltica <td>Watson-Marlow</td><td>313</td><td>- estensione extra della testa della pompa&nbsp;</td></tr><tr><td>323S/D pompa a velocità variabile a comando manuale</td><td>Watson-Marlow</td><td>323S/D</td><td>Pompa peristaltica</td></tr><tr><td>3L Sacchi da letto, sterili con rubinetti a leva&nbsp;</td><td>Sanità del Grande Orso&nbsp;</td><td>GDW173</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone polimerizzato al platino con diametro interno di 3 mm</td><td>Tubo per circuito AXM piccolo Fisher</td><td>10111801</td><td>(collegare il tubo della pompa ai modelli)</td></tr><tr><td>Tubo in silicone polimerizzato al platino con diametro interno di 5 mm Tubo</td> per <td>circuito AUM medio Fisher 10539201 (collegare il tubo della pompa al serbatoio AUM)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di ammonio (NH4Cl)</td><td>Fisher</td><td>11473713</td><td></td></tr><tr><td>solfato di sodio anidro (Na2SO4)</td><td>Fisher</td><td>11498717</td><td></td></tr><tr><td>Azlon Connettore conico&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>10712807</td><td>Utilizzato per collegare diverse lunghezze di tubi nel circuito AUM</td></tr><tr><td>Ganci per sacchi da letto&nbsp;</td><td>Sanità del Grande Orso&nbsp;</td><td>10705P</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tubi con rubinetto a pizzico Bochem, diametro 25 mm</td><td>Fisher</td><td>11805101</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>10021681</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato&nbsp;</td><td>Merck</td><td>C1909-500G</td><td>Utilizzato per rimuovere il biofilm cristallino dai modelli post-sperimentazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Pipette graduate in vetro di classe B di tipo 1 Fisher</td><td></td><td>11992168</td><td>Utilizzato per fornire modelli di blader in vitro con AUM tramite gelatina per tappo forato</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>24360.233</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism 10</td><td>GraphPad</td><td>V10.0</td><td>Software analitico utilizzato per la rappresentazione grafica dei risultati dei modelli di vescica in vitro e l'analisi statistica.</td></tr><tr><td>Hanna HI 2211-02 Misuratore di pH da banco</td><td>Phillip Harris&nbsp;</td><td>PP00057414</td><td></td></tr><tr><td>Modello in vitro vescica"...</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzature su misura come precedentemente descritto da Nzakizwanayo et al. (2019).</td></tr><tr><td>Gel lubrificante Instillagel 6 mL</td><td>mydoctorshop.co.uk</td><td>40-006</td><td>Gel lubrificanti utilizzati nella sezione 7.1.; altri fornitori sono disponibili.</td></tr><tr><td>Kartell Plastilab Connettore conico irregolare</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>11914289</td><td>Utilizzato per collegare tubi di diverso diametro</td></tr><tr><td>MacConkey agar senza sale (disidratato)</td><td>Fisher</td><td>10472643</td><td>Per il conteggio di singole colonie di batteri sciami, ad esempio Proteus mirabilis</td></tr><tr><td>cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2.6H2O)</td><td>Fisher</td><td>10386743</td><td></td></tr><tr><td>fosfato monopotassico (KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Connettore a forma di Y</td><td>Fisher</td><td>10186070</td><td>Utilizzato per eseguire più circuiti AUM da un serbatoio AUM (1-4 modelli per serbatoio)&nbsp;</td></tr>cloruro di <tr><td>potassio (KCl)</td><td>Flacone</td> aspiratore Fisher <td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex con presa laterale in vetro smerigliato, capacità: 5000 mL</td><td></td> Fisher <td>11347884</td><td>AUM</td></tr><tr><td>serbatoio Tappi in gomma con foro, diametro esterno: 37 mm, rosso, diametro: 37 mm</td><td>Fisher</td><td>11517612</td><td>Utilizzato nel serbatoio AUM e per fornire modelli in vitro con AUM</td></tr><tr><td>Taglia 14 francese 100 % silicone Catetere di Foley con siringa sterile di acqua per il gonfiaggio&nbsp;</td><td>Sanità del Grande Orso&nbsp;</td><td>4833-0514</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>10735921</td><td></td></tr><tr><td>ossalato di sodio (Na2C2O4)</td><td>Fisher</td><td>10442211</td><td></td></tr><tr><td>Teknon Biocleanse detergente biocida concentrato 5L&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12447580</td><td>Utilizzato per sterilizzare modelli post-sperimentazione</td></tr><tr><td>citrato trisodico (Na3C6H5O7)</td><td>Fisher</td><td>11434993</td><td></td></tr><tr><td>brodo di soia triptone</td><td></td><td></td> Fisher 10198002 <td></td></tr><tr><td>urea (CH4N2O)</td><td>Fisher</td><td>10404185</td><td></td></tr><tr><td>Uro-Tainer M NaCl 0,9%</td><td>B.Braun</td><td>FB99833</td><td>Sacca per irrigazione della vescica salina utilizzata nella sezione 7.2.</td></tr><tr><td>Tubi in silicone polimerizzato platino Watson-Marlow Pumpsil con diametro interno di 1,6 mm</td> Tubo per circuito <td>AUM spesso Fisher</td><td>12406280</td><td>(per l'uso in pompe verticali)</td></tr></tbody></table>

un modello in vitro della vescica di infezione del tratto urinario associata al catetere

An In Vitro Bladder Model of Catheter-Associated Urinary Tract Infection

Il successo del funzionamento del modello vescicale in vitro dipende dalla pratica di una buona tecnica asettica e da un'attenta osservazione della torbidità dei mezzi durante la sperimentazione (Figura 3). Prima dell'inoculazione, l'AUM sterile era di colore giallo pallido e trasparente nella camera centrale del modello vescicale in vitro (Figura 3A). L'AUM nel serbatoio del terreno deve rimanere chiara durante la sperimentazione, poiché qualsiasi variazione di torbidità che si verifica può indicare la precipitazione di sali dalla soluzione o la contaminazione del terreno. Se l'AUM nel serbatoio del fluido o nel tubo del circuito del fluido diventa torbido o mostra un drastico cambiamento di colore, le repliche devono essere scartate e ripetute. Dopo l'inoculazione, è chiaramente visibile un aumento della torbidità dell'AUM nella camera centrale del modello vescicale in vitro (Figura 3B). I cambiamenti nella torbidità sono spesso più pronunciati negli organismi ureasi-positivi come P. mirabilis, ma dovrebbero comunque essere visibili dopo l'inoculazione negli organismi ureasi-negativi. Dopo l'avvio del flusso di AUM, si osserva spesso una riduzione della torbidità dell'AUM quando le cellule planctoniche vengono lavate via e non indica una mancanza di cellule vitali nel modello. L'osservazione del livello del fluido nella camera centrale può essere utilizzata anche per determinare il tempo di blocco se si utilizzano organismi ureasi-positivi (Figura 3C). Mentre i modelli sono in funzione, l'occhiello e la punta del catetere devono essere completamente visibili per indicare il corretto drenaggio nei sacchetti dei rifiuti. In caso di blocco, il livello di AUM nella camera centrale salirà al di sopra dei fori per gli occhi e la punta del catetere, indicando che l'esperimento è pronto per qualsiasi lettura e terminazione del punto finale. Durante la sperimentazione, gli effetti della pressione nel circuito multimediale del modello di vescica in vitro possono far apparire i modelli bloccati. Se si sospetta un'ostruzione, verificare che il circuito AUM, il catetere e il tubo del sacchetto dei rifiuti siano tesi prima di terminare il test, poiché eventuali bolle d'aria o attorcigliamenti nel tubo possono causare "sacche d'aria" e impedire il drenaggio del catetere.
Durante gli esperimenti in vitro su modelli di vescica, il campionamento planctonico può fornire preziose informazioni sulle dinamiche di crescita all'interno del modello e sulla progressione di CAUTI. La crescita cellulare, il pH e la formazione di biofilm possono essere monitorati durante la sperimentazione senza richiedere la terminazione dei modelli (Figura 4). Se si utilizzano organismi urasi-positivi, i calcoli del tempo di blocco possono essere utilizzati come misura del tasso di formazione del biofilm e utilizzati per confrontare le proprietà di diversi ceppi batterici (Figura 4). Il confronto tra un ceppo wild-type di P. mirabilis e un mutante LPS (mini-tn5 insertion in waaC) ha dimostrato un'estensione del tempo di blocco e quindi una ridotta formazione di biofilm nel mutante (Figura 4). Gli organismi ureasi-negativi in genere non bloccano i modelli vescicali in vitro e si raccomanda quindi di determinare un endpoint prestabilito prima della sperimentazione. In alcuni casi, i microrganismi ureasi-negativi possono provocare il blocco del catetere. Ad esempio, i ceppi di Klebsiella pneumoniae negativi all'ureasi possono produrre ampi biofilm mucoidi, tuttavia, questi in genere impiegano molto più tempo dei biofilm positivi all'ureasi per bloccare il drenaggio, quindi si raccomanda ancora un endpoint prestabilito.
La misurazione del pH durante la sperimentazione di modelli di vescica può anche fornire informazioni sulle differenze tra ceppi e ceppi, nonché sui progressi di CAUTI. Se vengono utilizzati organismi ureasi-negativi, il pH nella camera centrale del modello di vescica in vitro dovrebbe rimanere in gran parte stabile durante la sperimentazione, anche se sono previste piccole fluttuazioni del pH man mano che la dinamica della popolazione cambia nel corso dell'esperimento. L'inoculazione di modelli in vitro con organismi positivi all'ureasi determina un aumento significativo del pH nel tempo, con il pH più alto che di solito si osserva al momento del blocco, dove si possono osservare letture di pH fino a ~8-9 (Figura 4B).
L'enumerazione delle CFU/mL planctoniche è una componente importante della modellazione vescicale in vitro , che consente agli operatori di valutare se l'inoculazione ha avuto successo e di monitorare l'andamento della sperimentazione. La misurazione di CFU/mL al termine della sperimentazione può evidenziare eventuali differenze nella colonizzazione vescicale tra diversi ceppi batterici. Confrontando il ceppo mutante mini-Tn5 di P. mirabilis con il wild-type, è stata osservata una significativa riduzione di CFU/mL al momento del blocco (Figura 4C). Inoltre, l'enumerazione delle CFU dai biofilm sulla superficie del catetere e la quantificazione della biomassa del biofilm possono fornire informazioni sulla capacità di diversi patogeni di colonizzare il tratto urinario cateterizzato. I coloranti cristallovioletto sono stati utilizzati per determinare le differenze nella formazione del biofilm tra un ceppo di P. mirabilis HI4320 wild-type e gli isolati passati in clorexidina (Figura 5). Le misure di densità ottica a 595 nm hanno dimostrato che gli isolati passati in clorexidina hanno mostrato una riduzione della formazione di biofilm rispetto al wild-type e ai controlli passati in assenza di clorexidina.
Poiché l'obiettivo del modello vescicale in vitro è quello di replicare accuratamente la nicchia CAUTI, i modelli possono essere utilizzati anche per studiare gli effetti delle terapie antimicrobiche volte a trattare CAUTI in un ambiente clinicamente rilevante. Per gli organismi ureasi-positivi, il confronto dei tempi di blocco dei modelli trattati con i modelli non trattati può fornire informazioni utili sull'efficacia del trattamento. Il trattamento di modelli vescicali in vitro inoculati con P. mirabilis con una soluzione di irrigazione vescicale di clorexidina allo 0,02% ha prolungato significativamente il tempo di blocco rispetto ai modelli che non sono stati trattati o trattati con soluzione fisiologica allo 0,9% (Figura 6A). Inoltre, il modello vescicale in vitro può essere utilizzato per studiare l'attività battericida delle terapie antimicrobiche. Il monitoraggio delle variazioni di CFU/mL delle cellule planctoniche e associate al biofilm dopo il trattamento antimicrobico può indicare se i trattamenti sono efficaci. Il trattamento di modelli vescicali in vitro inoculati con P. mirabilis ha dimostrato una riduzione di &gt;7 log di CFU/mL planctonica immediatamente dopo il trattamento, rispetto ai modelli non trattati e irrigati con soluzione salina allo 0,9% quando applicato secondo le istruzioni del produttore (Figura 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema dei principali componenti del modello vescicale in vitro . (A) Il modello a vescica (sistema di drenaggio chiuso): (1) camera di vetro a doppia parete che simula l'ingresso del fluido a vescica (2), l'AU viene fornita tramite pompa peristaltica alla camera interna del modello a vescica (3) ingresso dell'acqua fornito tramite bagno d'acqua circolante alla camera esterna (4) uscita dell'acqua (5) catetere di Foley, inserito nella camera interna (6) punto di connessione del lume di drenaggio; Punto di collegamento per sacco per rifiuti/sacche per irrigazione (7) Sacca di drenaggio per la raccolta del deflusso dell'urina. (B) Schema che descrive l'impostazione del modello di vescica in vitro e la direzione del flusso di mezzi e acqua attraverso il modello. L'urina artificiale viene conservata in un serbatoio di terreno (1) a temperatura ambiente e fornita al modello tramite una pompa peristaltica (2) a una velocità di flusso costante di ~ 0,75 mL min-1 per la durata dell'esperimento. Il terreno fluisce nella camera centrale del recipiente di vetro a doppia parete che rappresenta la vescica (3) e defluisce attraverso l'occhiello di un catetere di Foley (4) in una sacca di drenaggio (5), completando il sistema di drenaggio sterile chiuso. Il modello di vescica in vitro viene mantenuto a una temperatura costante di 37 °C tramite un bagno d'acqua circolante (6), che scorre attraverso la camera esterna del recipiente di vetro a doppia parete. Le linee tratteggiate rappresentano i tubi in silicone e le frecce rappresentano la direzione del flusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig02.jpg"> 
Figura 2: Sezionamento di cateteri urinari per elaborare le cellule associate al biofilm. Punti di esempio su un catetere urinario per la dissezione per la quantificazione del biofilm a valle. (A) I cateteri vengono prima sezionati latitudinalmente nella regione di 8 cm prossimale alla punta/fori per gli occhi (dove si osserva la maggior parte della formazione di biofilm). Le sezioni di 1 cm vengono rimosse con un bisturi, generalmente evitando la regione contenente il palloncino del catetere sgonfio a causa delle difficoltà di riproducibilità della lavorazione (1-3). (B) Una volta che i cateteri sono stati inizialmente sezionati in pezzi di 1 cm, viene eseguito un altro taglio longitudinale lungo il lume centrale per esporre l'eventuale biofilm presente per un'ulteriore quantificazione del biofilm, ad esempio l'enumerazione CFU/mL della colorazione con cristallovioletto. Le linee tratteggiate rappresentano i punti di dissezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig03.jpg"> 
Figura 3: Fasi di un esperimento in vitro su modello di vescica. Immagini del modello vescicale in vitro della camera centrale, attraverso le diverse fasi della sperimentazione. (A) AUM nella camera centrale del modello vescicale in vitro prima dell'inoculazione. Il terreno nella camera centrale è completamente trasparente, indicando l'esito positivo della sterilizzazione, mentre la punta del catetere e i fori per gli occhielli sono visibili sopra la linea del terreno, indicando che il catetere sta drenando correttamente. (B) Terreni nella camera centrale del modello vescicale in vitro dopo l'inoculazione con P. mirabilis (4 ore dopo l'inoculazione). Il successo dell'inoculazione è indicato dall'aumento della torbidità del terreno. La visibilità della punta del catetere e dei fori per gli occhi indica che l'AUM sta drenando correttamente attraverso il catetere e che non si è verificato alcun blocco. (C) Un esempio di modello di vescica bloccata in vitro . L'inoculazione con P. mirabilis e la successiva formazione e mineralizzazione del biofilm hanno provocato l'ostruzione dei fori oculari del catetere, impedendo il drenaggio e causando l'innalzamento del livello del terreno nella camera centrale al di sopra della punta del catetere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig04.jpg"> 
Figura 4: Le misurazioni del punto finale per un modello di vescica in vitro vengono eseguite fino al blocco. Esempi di misurazioni dell'endpoint al momento del blocco da un modello vescicale in vitro inoculato con un ceppo clinico di P. mirabilis, RS47 (WT), e un ceppo mutante con formazione di biofilm attenuata, RS47-2 (mutante). (A) Tempo di blocco (h) di WT e ceppi mutanti di P. mirabilis. (B) pH di modelli vescicali in vitro al momento del blocco. (C) CFU/mL di cellule planctoniche in camera modello vescicale in vitro al momento del blocco. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano l'errore standard della media (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Questa cifra è stata modificata da Clarke et al.46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig05.jpg"> 
Figura 5: Misurazioni delle cellule associate al biofilm dal modello vescicale in vitro . Quantificazione della formazione di biofilm di P. mirabilis , confronto del ceppo wild-type HI4320 con popolazioni adattate passate con o senza clorexidina (CHD) tramite colorazione cristallovioletto e misurazione della densità ottica (OD) a 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controlli di passaggio senza esposizione CHD; 2, 4, 6: HI4320 è passato in 4 μg/mL di CHD. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig06.jpg"> 
Figura 6: Misurazioni da modelli di vescica in vitro dopo il trattamento antimicrobico. I campioni planctonici sono stati prelevati da un modello di vescica in vitro inoculato con P. mirabilis, dopo l'irrigazione con una soluzione antimicrobica di clorexidina allo 0,02% (100 mL) o un controllo salino allo 0,9%. (A) Tempo di blocco di modelli vescicali in vitro dopo l'irrigazione. (B) CFU/mL planctonico immediatamente dopo il trattamento di irrigazione. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un modello in vitro della vescica di infezione del tratto urinario associata al catetere

Catheter-associated urinary tract infections (CAUTIs) are among the most common healthcare-associated infections. Biofilm formation on urinary catheters ...

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