Un modello in vitro della vescica di infezione del tratto urinario associata al catetere

- La nostra ricerca si concentra sulle infezioni del tratto urinario associate al catetere. Utilizziamo modelli in vitro come il modello della vescica per comprendere meglio gli agenti patogeni che causano le CAUTI.

Il modello vescicale in vitro fornisce un ambiente controllato per testare le applicazioni pratiche degli strumenti diagnostici e degli interventi terapeutici da utilizzare nel trattamento CAUTI.

Il cateterismo delle vie urinarie è una nicchia ambientale complessa con parametri importanti come la superficie del catetere e l'ambiente nutrizionale delle urine, che ne rendono difficile la replicazione in vitro.

Un obiettivo chiave della nostra ricerca è trovare modi per controllare la formazione di biofilm su dispositivi medici come i cateteri urinari per migliorare i risultati per i pazienti. Stiamo anche utilizzando i nostri modelli per studiare lo sviluppo della resistenza antimicrobica nelle comunità batteriche per rispondere alle domande su come si manifesta e cosa possiamo fare per prevenirla.

[Narratore] Per iniziare, inserire un catetere di Foley nella camera di vetro centrale del modello di vescica in vitro e fissare il catetere in posizione dopo aver gonfiato il palloncino utilizzando la siringa di acqua sterile fornita. Quindi, collegare la sacca dei rifiuti alla porta del catetere prima di collegare il dispositivo modello di vescica in vitro al serbatoio AUM. Ora, è possibile collegare i modelli di vescica in vitro ai supporti a morsetto. Collegare il tubo del circuito multimediale alla pompa peristaltica e fissare i sacchetti dei rifiuti nei supporti posizionati sotto i modelli. Collegare la camera esterna del modello a vescica a un bagno d'acqua circolante utilizzando un tubo in silicone. Impostare il bagno d'acqua per riscaldare a 37 gradi Celsius e accendere i circolatori del serbatoio. Sterilizzare il modello di vescica in vitro utilizzando etanolo al 70%. Rimuovere il tappo all'ingresso del fluido per rendere accessibile la camera interna. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere 10 millilitri di AUM dal volume del modello vescicale. Inoculare i modelli vescicali in vitro attraverso la camera centrale utilizzando l'intera sospensione normalizzata da 10 millilitri e mescolare accuratamente. Utilizzando la pipetta, rimuovere 10 millilitri del campione inoculato dalla camera centrale e aliquotarli in una provetta universale da 15 millilitri per i saggi successivi. Dopo aver decontaminato le superfici esterne, riposizionare il tappo e riprendere brevemente il flusso del fluido per assicurarsi che il livello di AUM nella camera centrale raggiunga il foro dell'occhio, quindi interrompere il flusso. Dopo un'incubazione di un'ora, attivare il flusso del terreno utilizzando la pompa peristaltica per iniziare a far funzionare i modelli vescicali in vitro. Dopo aver decontaminato il tappo del modello a vescica, rimuoverlo per accedere alla camera centrale. Utilizzando una pipetta sierologica, mescolare delicatamente il contenuto della camera centrale, evitando la punta del catetere e il palloncino. Quindi, rimuovere un millilitro dal campione utilizzando una pipetta e aliquotarlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per diluizioni seriali. Misurare il pH del campione rimanente utilizzando un pHmetro. Scollegare la sacca dei rifiuti dal catetere e drenare l'urina residua dal modello sgonfiando il palloncino. Rimuovere il catetere dalla parte inferiore del modello utilizzando una pinza sterile. Ora, posizionare il catetere rimosso su una tavola sterile e, utilizzando un bisturi sterile, tagliare il catetere nei punti necessari per il sezionamento. Utilizzando una pinza sterile, immergere la sezione del catetere tre volte in PBS sterile per rimuovere le cellule non aderenti e incubare la sezione del catetere preparata in tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, sonicare la soluzione contenente il catetere per 10 minuti. Utilizzando la tecnica asettica, inserire l'estremità della siringa contenente l'agente lubrificante nel collo del modello di vescica e iniettare cinque millilitri di gel. Ruotare il modello per assicurarsi che la base sia uniformemente ricoperta di gel. Per inserire un catetere di Foley nel modello, spingere la punta del catetere attraverso il gel e fissarla dopo aver riempito il palloncino normalmente. Collega il modello al resto della configurazione. Quindi, riempire il lume del modello con l'urina fino a quando non inizia a defluire attraverso il foro dell'occhio del catetere. Non appena l'urina inizia a defluire, arrestare la pompa per evitare la perdita di gel prima dell'inoculazione. Al momento dell'accensione della pompa dopo l'inoculazione, prelevare le diluizioni per il conteggio delle unità formanti colonie. Se si utilizza una sacca di irrigazione individuale, scollegare la sacca di scarto dal catetere e utilizzare il tappo fornito con la sacca per sigillare la sacca di scarto. Collegare immediatamente la sacca della soluzione di irrigazione al catetere e, esercitando una leggera pressione, spremere il prodotto nel lume centrale seguendo le istruzioni del produttore per 15 minuti. Una volta completato il tempo di trattamento consigliato, lasciare che la soluzione residua defluisca dalla camera interna attraverso il foro dell'occhiello del catetere nella sacca di irrigazione, quindi scollegare la sacca. Sterilizzare la porta di drenaggio del catetere e la porta di connessione della sacca dei rifiuti con etanolo al 70% prima di ricollegarle. Per terminare l'esperimento, chiudere il flusso del bagno d'acqua e scollegare il circuito del fluido e il tubo del circuito del bagno d'acqua dai modelli di vescica in vitro. Dopo aver rimosso i tappi, raccogliere l'intero volume di urina residua, scolare i sacchetti per i rifiuti ed eliminare i residui di terreno. Quindi, scollegare le sacche di scarto del catetere dalla porta del catetere e gettarle. Infine, utilizzando una siringa, sgonfiare lentamente i palloncini del catetere prima di rimuovere i cateteri dai modelli. Dopo l'inoculazione del modello vescicale, il tempo di blocco è stato significativamente esteso nel ceppo mutante mini-Tn5 di Proteus mirabilis rispetto al ceppo wild type, indicando una ridotta formazione di biofilm. Le unità di formazione di colonie planctoniche per millilitro al momento del blocco erano significativamente ridotte nel ceppo mutante mini-Tn5 rispetto al tipo selvatico. La colorazione con cristallovioletto ha dimostrato che gli isolati di Proteus mirabilis passati in clorexidina hanno mostrato una significativa riduzione della biomassa del biofilm rispetto a quelli che passano senza clorexidina. Il trattamento di modelli vescicali in vitro con irrigazione con clorexidina allo 0,02% ha prolungato significativamente il tempo di blocco e ridotto le unità formanti colonie planctoniche per millilitro rispetto ai controlli non trattati e trattati con soluzione salina.