Identificazione della microglia e dei macrofagi infiltranti periferici nel midollo spinale danneggiato mediante citometria a flusso

La nostra ricerca identifica le microglia e i macrofagi infiltranti nelle lesioni del midollo spinale per chiarire i loro ruoli nella neuroinfiammazione utilizzando la citometria a flusso ottimizzata. La citometria a flusso e la centrifugazione in gradiente di densità sono fondamentali per isolare e fenotipizzare le cellule immunitarie del sistema nervoso centrale con elevata specificità ed efficienza. Distinguere microglia e macrofagi morfologicamente simili, minimizzando la perdita cellulare durante l'isolamento e una microspecificità inferiore nei microambienti con lesione dinamica rimangono ostacoli chiave. I metodi esistenti non riescono a separare in modo affidabile le microglia residenti dai macrofagi infiltranti. Il nostro approccio basato su marcatori risolve questa limitazione critica negli studi sulle lesioni del midollo spinale.

[Presentatore] Per iniziare, analizzare la provetta di controllo dell'isotipo utilizzando il citometro a flusso con il software compatibile. Regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale per posizionare la popolazione cellulare entro un intervallo appropriato. Imposta due grafici aggiuntivi, uno con IgG APC sull'asse X e IgG PE sull'asse Y, un altro con IgG-FITC sull'asse X e IgG APC-Cy7 sull'asse Y. Quindi regolare le tensioni del canale di fluorescenza per IgG APC, IgG PE, IgG FITC e IgG APC-Cy7 per posizionare la popolazione cellulare entro 10 alla potenza di tre della regione doppia-negativa. Dopo aver confermato le tensioni ottimizzate utilizzando il tubo di controllo dell'isotipo, mantenere tutte le impostazioni. Procedere con l'analisi delle provette sperimentali colorate con anticorpi. Stabilisci un grafico con CD11b PE sull'asse X e dispersione laterale sull'asse Y. Imposta un altro grafico con CD68 FITC e CCR7 APC-Cy7. Utilizzando il controllo isotipo come riferimento, delineare la regione CD11b-positiva e definirla come porta P1. Selezionare il grafico CD68 FITC e CCR7 APC-Cy7. Fare clic con il pulsante destro del mouse per aprire Mostra popolazione e assegnare la colonna F4 a P1. Dopo aver acquisito i dati, regolare la compensazione della fluorescenza secondo necessità. Analizzare e registrare la percentuale di popolazioni cellulari CD11b, CD68, CCR7-positive e CD11b, CD68-positive, CCR7-negative. Iniziare ad analizzare le valvole sperimentali utilizzando le impostazioni di tensione della valvola di controllo dell'isotipo. Stabilisci un grafico con CD45 APC e CD11b PE. Quindi impostare due grafici con CD68 FITC e CCR7 APC-Cy7. Acquisisci 50.000 eventi per campione e regola la compensazione della fluorescenza dopo la raccolta dei dati. Nei grafici a pseudocolori di CD45 e CD11b, identificare e analizzare le regioni per le cellule CD11b-positive, CD45-negative basse e CD11b-positive CD45 alte. Quindi analizza le popolazioni CD68-positive, CCR7-positive e CD68-positive CCR7-negative all'interno di ciascuna regione. Integra tutte le analisi per determinare la percentuale di microglia e macrofagi M1-like e M2-like nelle regioni definite. Avviare il software di analisi della citometria a flusso. Trascinare i file dell'esperimento di citometria a flusso nella sezione Tutti i campioni dell'interfaccia. Fare doppio clic sul campione di controllo dell'isotipo per aprire un grafico a punti bidimensionale. Selezionare FSCA per l'asse X e SSCA per l'asse Y, quindi fare clic sul pulsante del gate rettangolare e utilizzarlo per selezionare l'area che esclude i detriti cellulari. Fare doppio clic sull'area chiusa per aprire un nuovo grafico a istogramma. Quindi selezionare FITC per l'asse X e istogramma per l'asse Y. Fare clic sul pulsante del gate di regione per definire la soglia tra i segnali fluorescenti negativi e positivi. Per ciascuno dei quattro anticorpi fluorescenti, determinare la soglia tra segnali negativi e positivi utilizzando il campione di controllo dell'isotipo. Cambia in sequenza il fluorocromo dell'asse X in PE-APC e APC-Cy7 mantenendo l'istogramma dell'asse Y. Utilizzare lo strumento region gate in ciascun istogramma per finalizzare i gate per distinguere i segnali fluorescenti negativi e positivi per i quattro anticorpi. Quindi, fare doppio clic sul campione sperimentale per aprire un grafico a punti. Selezionare FSCA per l'asse X e SSCA per l'asse Y, fare clic sul pulsante del cancello rettangolare per bloccare la popolazione dopo aver rimosso i detriti. Fare doppio clic sull'area chiusa per aprire un nuovo grafico a punti. Selezionare CD11b PE per l'asse X e SSCA per l'asse Y. Fare clic sul pulsante del gate rettangolare e utilizzare la soglia PE dal controllo dell'isotipo per definire il gate CD11b-positivo. Ora fai doppio clic sulla regione CD11b-positiva per aprire un altro grafico a punti, seleziona CD68 FITC per l'asse X e CCR7 APC-Cy7 per l'asse Y. Fare clic sul pulsante a croce e utilizzare le soglie FITC e APC-Cy7 derivate dall'isotipo per classificare le celle in tipi M1-like e M2-like. La percentuale di cellule CD45 CD11b-positive CD68-positive CCR7-positive era significativamente aumentata nel gruppo veicolo per lesione del midollo spinale, o SCI, rispetto al gruppo sham, e il trattamento con CRID3 non ha alterato questo livello. La percentuale di cellule CD45-negative CD11b-positive CD68-positive CCR7-positive era significativamente più alta nel gruppo veicolo SCI rispetto allo sham, ed era significativamente ridotta dopo il trattamento con CRID3. Le proporzioni di cellule CD11b-positive CD68-positive CCR7-positive sono risultate significativamente aumentate nel gruppo veicolo SCI rispetto agli sham e sono diminuite significativamente dopo il trattamento con CRID3. CD11b-positivi, CD68-positivi, CCR7-negativi e CD45-negativi, CD11b-positivi, CD68-positivi, CCR7-negativi, le proporzioni cellulari sono risultate significativamente diminuite in entrambi i gruppi di veicoli SCI rispetto agli sham e aumentate dopo il trattamento con CRID3.