Isolamento, fissazione e caratterizzazione di leucociti renali giovanili di orata mediante citometria a flusso

Questo protocollo standardizza l'isolamento, la fissazione e la valutazione della vitalità dei leucociti dal rene della testa dell'orata mediante citometria a flusso, consentendo l'elaborazione di campioni ad alto rendimento senza compromettere la qualità.

Le tecniche tradizionali come il conteggio manuale delle cellule con camere di Neubauer e gli strisci di sangue colorati sono comuni nell'immunologia dei pesci. La citometria a flusso sta diventando popolare, ma la sua applicazione negli studi sui pesci rimane limitata. I metodi tradizionali di immunologia dei pesci sono ad alta intensità epatica e soggetti a errori. Gli studi su animali giovani sono limitati dalle difficoltà nell'ottenere leucociti puri e dalla necessità di una valutazione immediata della vitalità, limitando la produzione di campioni.

Questo protocollo consente un'analisi dettagliata delle cellule immunitarie identificando le popolazioni di leucociti chiave e distinguendo le cellule vive da quelle morte. La fissazione preserva la vitalità per un mese, consentendo flussi di lavoro di citometria a flusso scalabili, flessibili ed efficienti.

I nostri risultati fanno progredire l'immunologia dei pesci rivelando i meccanismi immunitari e gli impatti ambientali sulla vitalità cellulare, aiutando lo sviluppo di migliori strategie di gestione delle malattie in acquacoltura.

[Narratore] Per iniziare, acclimatate il novellame di orata, Sparus aurata, in sistemi di acquacoltura a ricircolo dove l'acqua viene continuamente filtrata e ricircolata per mantenere un ambiente stabile. Assicurarsi che il sistema includa la filtrazione meccanica e biologica, l'aerazione e il controllo della temperatura per mantenere i parametri abiotici ottimali. Regolare fattori ambientali come fotoperiodo, temperatura, salinità, pH e livelli di ossigeno disciolto in base alle esigenze specifiche dello studio. Usa una rete per trasferire delicatamente il novellame di orata in un contenitore temporaneo riempito con acqua della vasca. Dopo l'eutanasia del pesce, posiziona un pesce su un lato su un vassoio di dissezione sterile. Con un bisturi, praticare un'attenta incisione lungo la linea mediana ventrale del pesce dallo sfiato verso le branchie. Usa le forbici da dissezione per estendere l'incisione ed esporre gli organi interni. Localizzare il rene della testa, che si trova appena dietro le branchie vicino alla regione dorsale anteriore della cavità corporea e si estende lungo il lato superiore sotto la colonna vertebrale. Con un paio di pinze e forbici a punta fine, elimina con cura i tessuti circostanti per visualizzare meglio il rene della testa. Quindi solleva il rene della testa e fai dei tagli precisi attorno ad esso per liberarlo dai tessuti circostanti. Posizionare immediatamente il rene di testa asportato in un colino cellulare posizionato all'interno di una capsula di Petri sterile. Pipettare due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks, o HBSS, in una capsula di Petri sterile. Macerare il rene di testa asportato sul filtro cellulare utilizzando lo stantuffo di una siringa per rilasciare le cellule nella soluzione. Quindi, preparare una soluzione di mezzo a gradiente di densità. Pipettare 600 microlitri della soluzione di terreno a gradiente di densità in provette da cinque millilitri di polistirene a fondo tondo. Trasferire lentamente due millilitri di sospensione cellulare dalla piastra di Petri in ciascuna provetta. Centrifugare a 400 g per 45 minuti a quattro gradi Celsius con il freno spento. Dopo la centrifugazione, rimuovere la provetta e osservare l'anello leucocitario. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur sterile per trasferire delicatamente circa 100 microlitri dell'anello leucocitario in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Ora, portare il volume a due millilitri con HBSS e risospendere delicatamente le cellule. Centrifugare il campione a 400 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet sul fondo della provetta. Quindi, risospendere il pellet purificato in un millilitro di HBSS fino a quando la concentrazione finale delle cellule è compresa tra 10.000 e un milione di cellule per millilitro. Aggiungere 50 microlitri di dimetilsolfossido in una fiala contenente il colorante reattivo. Dopo aver regolato la densità cellulare a un milione di cellule per millilitro, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da due millilitri. Preparare i campioni di controllo della vitalità come indicato. Indurre la morte cellulare nelle provette tre e quattro mettendole in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per sette minuti. Per colorare le cellule, pipettare un microlitro del colorante fluorescente ricostituito in provette due e quattro contenenti un millilitro di sospensione cellulare e mescolare bene. Incubare le provette colorate a temperatura ambiente per 30 minuti, al riparo dalla luce. Successivamente, lavare le celle due volte con un millilitro di HBSS e risospendere il pellet finale in 900 microlitri dello stesso tampone. Quindi pipettare 100 microlitri di formaldeide al 37% per fissare le cellule e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo aver lavato le cellule due volte con un millilitro di HBSS contenente l'1% di BSA, risospendere in un millilitro della stessa soluzione. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius in frigorifero per un massimo di un mese. Posizionare la provetta del campione fissa nella porta del campione del citometro a flusso per l'analisi. Registra un minimo di 10.000 eventi per ogni campione all'interno del cancello dei singolettori. Salva tutti i dati ed esegui il backup su unità esterne o cloud storage. Visualizzare i dati della citometria a flusso tracciando l'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale per valutare le dimensioni e la granularità delle cellule. Esegui il gating delle celle singoletto ed escludi i multipletti tracciando l'area di dispersione in avanti rispetto all'altezza di dispersione in avanti. Identificare le tre popolazioni di leucociti in base ai profili di dispersione in avanti rispetto a quelli laterali. Impostare la soglia per la colorazione del colorante di vitalità nel canale di fluorescenza corrispondente per distinguere le cellule vive da quelle morte. In condizioni ottimali, i linfociti, i monociti e i granulociti costituivano rispettivamente il 31%, il 38% e il 31% della popolazione leucocitaria, mentre in condizioni di stress termico, i linfociti sono diminuiti al 21,3%, i monociti sono aumentati al 45,6% e i granulociti sono rimasti stabili al 33,1%. Il campione esposto a condizioni ottimali ha mostrato una maggiore vitalità, con una predominanza di cellule vive in tutte le popolazioni di leucociti. Al contrario, il campione sottoposto a stress termico ha mostrato un aumento significativo della morte cellulare.