Indagini multiscala sull'elaborazione corticale integrando politrodi laminari e optogenetica con la microcorticografia nei roditori

Come i laboratori studiano come l'attività cerebrale dà origine a funzioni, come la percezione e la cognizione, utilizzando ECOG e altri strumenti per collegare l'attività neuronale locale con i segnali corticali su scala più ampia.

Le registrazioni di spike extracellulari nell'imaging a due fotoni vengono utilizzate per misurare l'attività della popolazione, ma l'ECOG è una delle poche tecniche disponibili sia nell'uomo che per la ricerca di base sugli animali.

L'attività cerebrale si estende su molte scale spaziali e temporali. Nessun metodo di segnale li cattura tutti in una volta, ma ECOG ha una risoluzione temporale e spaziale sufficiente per molte domande critiche.

Il nostro protocollo colma una lacuna chiave combinando ECOG con registrazioni locali e optogenetica, fornendo efficacemente informazioni su microscala dai segnali della superficie corticale su mesoscala.

I nostri risultati amplieranno l'uso di ECOG come parte di paradigmi sperimentali multimodali per studiare i principi fondamentali dell'organizzazione neocorticale e rivelare biomarcatori di specifiche funzioni corticali nell'uomo.

[Istruttore] Per iniziare, posiziona un topo anestetizzato su un lettino chirurgico e usa una pinzetta per sollevare un punto sulla pelle sopra il cranio. Quindi, utilizzando le forbici chirurgiche, resecare una porzione di circa un centimetro di diametro della pelle. Con un raschietto, rimuovere il tessuto connettivo e il periostio dalla parte superiore del cranio. Sciacquare la soluzione salina sul cranio. Successivamente, utilizzare un trapano chirurgico impostato a bassa velocità per praticare un foro di fresatura nella parte frontale dell'emisfero omolaterale all'area registrata. Praticare una trincea poco profonda sul perimetro per definire il contorno della craniotomia. Quando il cranio è stato assottigliato al punto in cui una pressione estremamente leggera provoca un'oscillazione visibile dell'intera finestra, rimuovere la parte assottigliata. Applicare regolarmente la soluzione salina e utilizzare una spugna emostatica per mantenere umido il cervello. Ora, inserisci il filo di riferimento d'argento di circa un millimetro nel foro della fresa in modo che entri in contatto con la superficie del cervello senza causare sanguinamento. Dopo aver impiantato la barra per la testa, posizionare l'animale nella configurazione di registrazione. Ora fissate la griglia per micro-elettrocorticografia all'headstage utilizzando i connettori a clip con forza di inserimento zero. Tenere in posizione la scheda elettronica dell'headstage utilizzando una barra meccanica fissata a un micromanipolatore. Abbassare orizzontalmente la griglia della micro-elettrocorticografia per allinearla in piano sopra la craniotomia lungo l'asse anteroposteriore. Una volta che la griglia è vicina al cervello senza toccarlo, collegare il filo di riferimento della griglia al perno d'oro del filo d'argento impiantato. Quindi, abbassa ulteriormente la griglia per entrare in contatto con il cervello. Spostare la griglia lateralmente per scivolare sulla superficie umida della dura madre e continuare a regolare fino a quando non è centrata lungo l'asse mediolaterale. Utilizzare l'aspirazione o una spugna chirurgica attorno ai bordi della craniotomia per rimuovere la soluzione salina in eccesso. Una volta che la preparazione è leggermente più asciutta, verificare che la griglia aderisca più saldamente alla dura madre e non scivoli. Applicare un movimento laterale a mediale alla griglia per garantire il contatto con gli elettrodi più laterali mentre il cavo della griglia si piega per adattarsi al contorno del cervello. Osservare l'attività elettrofisiologica utilizzando il software di registrazione. In anestesia leggera, monitorare i modelli di segnale cerebrale variabili. Assicurarsi che i cavi di rete, di riferimento e di terra siano collegati correttamente per ottenere un elevato rapporto segnale/rumore. Utilizza il software Trodes con filtro passa banda tra 300 e 6.000 hertz per monitorare il rumore nella gamma delle alte frequenze e assicurarti che rimanga entro decine di microvolt. Valutare la reattività sensoriale generando stimoli sonori, come battere le mani o schioccare le dita, e osservare i corrispondenti potenziali elettrici della superficie corticale. Accendi la luce optogenetica a bassa intensità per guidare la sorgente luminosa e aiutare a posizionare la fibra, quindi usa il braccio articolato per posizionare approssimativamente la luce optogenetica verso l'area target. Metti a fuoco e regola con precisione la posizione della fibra utilizzando un micromanipolatore o viti di regolazione fine prima di registrare i segnali. Per pulire la griglia, se il cervello è asciutto, applicare una piccola goccia di soluzione salina sulla superficie del cervello usando una siringa e lasciarla riposare per 30 secondi a un minuto prima di sollevare la griglia. Lavorando al microscopio, sollevare delicatamente la griglia dalla superficie del cervello utilizzando micromanipolatori. Una risposta elettrocorticografica localizzata è stata osservata circa 10 millisecondi dopo la stimolazione con un singolo baffo, con ampiezze di deflessione di picco intorno a un millivolt. La risposta dell'elettrodo più forte è stata evocata dalla stimolazione del baffo corrispondente, mentre una risposta più debole o assente è stata osservata dai baffi più distanti. L'inibizione optogenetica ha portato ad una soppressione della risposta corticale evocata dai baffi solo negli animali che esprimono opsine inibitorie. Gli artefatti optoelettrici sono apparsi solo all'inizio e all'offset della stimolazione dell'impulso luminoso di cinque secondi utilizzando la fibra di grande diametro. La fibra ottica da un millimetro ha prodotto un grande artefatto luminoso sulla griglia di micro-elettrocorticografia, mentre la fibra da 200 micrometri ha ridotto significativamente questo artefatto. Le registrazioni di micro-elettrocorticografia nei ratti hanno mostrato forti risposte evocate uditive, con un picco di risposta intorno a 25-30 millisecondi dopo lo stimolo. Nello spettro di frequenza della risposta evocata sono stati osservati picchi di attività gamma elevati, ultra alti gamma e multi-unità, con gamma alta come componente dominante. La micro-elettrocorticografia è stata registrata insieme alle registrazioni della sonda laminare. Nelle registrazioni di politrodi sono state rilevate chiare forme d'onda spike, che mostrano una forma d'onda distinta su più canali. I grafici dell'ampiezza della risposta in frequenza degli elettrodi di micro-elettrocorticografia di superficie corrispondono strettamente a quelli degli elettrodi in politrodo laminare in profondità, dimostrando una sintonizzazione uditiva coerente. Una mappa tonotopica ad alta risoluzione generata da segnali ad alta gamma ha rivelato l'organizzazione funzionale dei campi corticali uditivi, comprese le aree primarie, posteriori e ventrali.