Name: Un semplice metodo di doppia provetta per centrifugazione per ottenere plasma ricco di piastrine dal sangue equino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri un metodo semplice ed economico per preparare plasma ricco di piastrine dal sangue equino. Questa tecnica di centrifugazione in doppia provetta garantisce concentrazione piastrinica elevata e riduzione dei leucociti per la medicina rigenerativa veterinaria.

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Questo studio è stato condotto in conformità con i protocolli interni per la preparazione e l'uso del PRP nei cavalli presso l'Ospedale Universitario Veterinario dell'Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Questo studio non ha richiesto l'approvazione del Comitato Interno per la Cura degli Animali poiché i dati sono stati ottenuti da cavalli zoppi trattati clinicamente presso il nostro istituto. Per sviluppare questo protocollo sono stati utilizzati i dati di sei cavalli creoli colombiani, tre fattrici e tre castrati, con un'età media di 7,4 (± 2,6) anni. I proprietari dei cavalli sono stati informati della natura dello studio e hanno firmato un modulo di consenso informato. Tutti i cavalli inclusi nello studio erano clinicamente sani, ad eccezione del problema muscoloscheletrico da trattare. Sono stati inclusi solo gli animali con una conta piastrinica basale superiore a 100 × 103/mL di sangue intero. È importante notare che i cavalli con concentrazioni piastriniche più basse possono essere considerati trombocitopenici14. Inoltre, questi animali hanno mostrato un normale esame emocromocitometrico, parametri biochimici clinici epatici e renali e valori di analisi delle urine entro l'intervallo normale per la specie equina.
1. Restrizione del cavallo e disinfezione della pelle
<ol>
	<li>Per la sicurezza sia del cavallo che del veterinario, trattenere saldamente il cavallo (Eqqus caballus) in uno scivolo per esami clinici o con una briglia (Figura 1A), a seconda del comportamento dell'animale. Quindi, taglia un'area di peli di 5 cm x 5 cm con un rasoio elettrico nel terzo medio di un lato del collo, sopra la vena giugulare. NOTA: Alcuni proprietari preferiscono che il cavallo non venga tosato. Uno studio indica che il taglio dei capelli nel sito di venipuntura non è necessario per prevenire la contaminazione batterica di P-PRP21. Pertanto, questa procedura è a discrezione del veterinario.</li>
	<li>Eseguire una preparazione preliminare della pelle non sterile sull'area tagliata della vena giugulare per almeno 10 cm utilizzando una garza e guanti non sterili per circa 3 minuti. Applicare diversi pezzi di garza imbevuti di schiuma antisettica in uno schema circolare (Figura 1B).</li>
	<li>Preparare il sito di puntura venosa in modo asettico utilizzando sia guanti sterili che garze imbevute di disinfettante. Strofinare la pelle nella zona del collo con un movimento circolare per circa 5 minuti. Pulire l'area con una garza sterile imbevuta di alcol etilico al 95%.</li>
</ol>
2. Prelievo asettico del sangue
<ol>
	<li>Mettere 16 provette da 4,5 mL di citrato di sodio, precedentemente pulite con una garza imbevuta di alcol etilico al 95%, in una griglia di plastica pulita. Impregnare i cappucci in gomma dei tubi a vuoto con alcol etilico al 95%, soprattutto nell'incavo per l'accoppiamento dell'ago. NOTA: In generale, sono necessarie otto provette da 4,5 ml di citrato di sodio per ottenere 2,5 ml di PRP. Il numero di tubi utilizzati in un caso particolare dipenderà dai tessuti molli o dall'articolazione specifica da trattare.</li>
	<li>Inserire sterilemente un ago a farfalla nel sito giugulare disinfettato (Figura 2A) e collegare provette da 4,5 ml di citrato di sodio al supporto (Figura 2B). Agitare delicatamente le provette e metterle in una griglia di plastica. NOTA: Una provetta da 4,5 mL di citrato di sodio viene utilizzata per gli emogrammi automatizzati e per preparare il plasma dopo la centrifugazione a centrifugazione dura. Questo plasma viene quindi utilizzato come controllo negativo per il confronto dei fattori di crescita e dell'arricchimento di citochine con il PRP.</li>
</ol>
3. Approvvigionamento di plasma ricco di piastrine
<ol>
	<li>Posizionare le provette da 4,5 mL di citrato di sodio contenenti sangue intero in un rotore oscillante a quattro posizioni con un angolo di 90° in una centrifuga da banco. Centrifugare le provette a 120 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, posizionare le provette da 4,5 mL contenenti sangue citrato e altre due provette lisce da 10 mL in un rack e posizionare il rack sul lato non dominante della mano dell'operatore all'interno di una cappa a flusso laminare di classe II su un telo sterile e impermeabile. NOTA: Uno studio suggerisce che una cappa a flusso laminare di Classe II non è essenziale per prevenire la contaminazione batterica durante l'approvvigionamento di PRP21. Invece, il PRP può essere preparato in una camera bianca priva di correnti d'aria e polvere. In questo scenario, il rack per provette di sangue può essere posizionato su un tavolo coperto da un telo sterile e impermeabile.</li>
	<li>Prima centrifugazione: Indossando una maschera facciale e guanti sterili, posizionare una siringa luer sterile da 10 ml accoppiata con un ago sterile (21 G 5/8") sul lato dominante della mano all'interno della cappa a flusso laminare. NOTA: Da questo momento in poi, la mano guantata dominante rimane sempre sterile, mentre i cappucci in gomma delle provette di citrato di sodio devono essere rimossi utilizzando la mano guantata non dominante.</li>
	<li>Inserire l'ago sterile in ogni provetta di sangue cittrato centrifugato a 3 mm sopra il buffy coat (Figura 3A) e aspirare delicatamente il 50% della frazione plasmatica, evitando turbolenze di liquidi e aspirazione di sangue. Una volta aspirati 10 mL di plasma da quattro provette da 4,5 mL, distribuirli in provette semplici sterili da 5-10 mL (Figura 3B). NOTA: Rimuovere i tappi di gomma di questi tubi con la mano non dominante e posizionarli su un sito sterile del telo o tenerli per evitare la contaminazione batterica.</li>
	<li>Seconda centrifugazione: richiudere le provette con i tappi di gomma e posizionarle in uno stato di equilibrio in un rotore oscillante a quattro posti con un angolo di 90° nella centrifuga da banco e far girare queste provette a 240 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: La scelta della forza di centrifugazione relativa (RCF o g) si basa su uno studio seminale14 che ha descritto per la prima volta questo metodo per ottenere PRP dal sangue equino. Inoltre, la riproducibilità di questo metodo è stata valutata da altri autori22.</li>
	<li>Posizionare le provette in una rastrelliera e posizionarle sul lato non dominante all'interno della cappa a flusso laminare di classe II, sopra il telo precedentemente posato, sterile, impermeabile.</li>
	<li>Utilizzare la mano non dominante per rimuovere i cappucci di gomma e la mano dominante sterile per aspirare lentamente il primo 75% di plasma utilizzando un ago spinale da 18 G e 90 mm collegato a una siringa luer sterile da 10 ml (Figura 3C). Gettare questa siringa o riservarla per altri usi sperimentali o clinici poiché contiene plasma povero di piastrine (PPP). Quindi, collegare l'ago spinale sterile precedentemente utilizzato a una siringa luer sterile da 5 o 10 ml per aspirare il plasma rimanente (25%) dalla provetta liscia sterile da 5-10 ml. Questa frazione è nota come P-PRP (Figura 3D). NOTA: In determinate condizioni cliniche e sperimentali, un'aliquota di 0,5-1 mL di PRP viene utilizzata per gli emogrammi automatizzati seguiti dall'analisi del fattore di crescita (TGF-β1 e PDGF-BB) mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico. La misurazione di questi mediatori può essere effettuata 3 ore dopo l'attivazione del P-PRP con sali di calcio o trombina23 o dopo aver indotto un danno cellulare mediante variazione di temperatura o aggiunta di detergenti non ionici24.</li>
	<li>Avvolgere la siringa luer sterile contenente PRP in un piccolo telo sterile impermeabile con un ago o un cappuccio sterile attaccato per prevenire la contaminazione batterica del prodotto ortobiologico (Figura 4A). NOTA: La struttura anatomica del cavallo da trattare deve essere preparata per l'iniezione asettica come descritto nella sezione 1 di questo protocollo. Il cavallo deve essere adeguatamente trattenuto e sedato per ridurre al minimo il disagio e garantire la sicurezza sia del cavallo che del veterinario. Il prodotto PRP deve essere maneggiato utilizzando guanti e aghi sterili e può essere attivato o meno in base alle preferenze del medico (Figura 4B).</li>
</ol>
4. Analisi statistica
<ol>
	<li>Raccogli dati sulla conta piastrinica e leucocitaria nel sangue intero e nel PRP. Valutare i dati per la normalità utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Se i dati sono distribuiti normalmente (P &gt; 0,05), confrontare e analizzare i dati delle celle utilizzando il t-test. Se i dati sulla concentrazione di piastrine e leucociti non sono distribuiti normalmente (P &lt; 0,05), confrontare e analizzare i dati utilizzando un test di Wilcoxon.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di efficienza piastrinica e leucocitaria nel P-PRP secondo le seguenti formule25: Efficienza di raccolta piastrinica = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100 Efficienza di raccolta dei leucociti = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq02.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Raccogliere dati dalle concentrazioni di TGF-β1 e PDGF-BB nei surnatanti PRP plasmatici (controllo negativo) (dopo 3 ore di attivazione con gluconato di calcio) e lisati di PRP ottenuti mediante l'aggiunta di una soluzione detergente non ionica.</li>
	<li>Utilizzare un modello misto lineare generalizzato per confrontare le concentrazioni dei fattori di crescita tra plasma, surnatanti PRP e lisato di PRP. In caso di differenze statistiche significative, applicare un test post-hoc di Tukey.</li>
	<li>Considera p &lt; valori 0,05 statisticamente significativi per tutti i test.</li>
</ol>

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<li>Castillo-Franz, C., López, C., Carmona, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+catabolic+and+anabolic+gene+expression+effects+and+histology+changes+induced+by+platelet-rich+gel+supernatants+in+equine+suspensory+ligament+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22MLTJ-Muscles+Ligaments+and+Tendons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the catabolic and anabolic gene expression effects and histology changes induced by platelet-rich gel supernatants in equine suspensory ligament explants challenged with lipopolysaccharide.</a> MLTJ-Muscles Ligaments and Tendons. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Argüelles, D., Carmona, J. U., Climent, F., Muñoz, E., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+for+musculoskeletal+lesions+in+five+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions in five horses.</a> Vet Rec. 162 (7), 208-211 (2008).</li>
<li>Carmona, J. U., Argüelles, D., Climent, F., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+of+horses+with+osteoarthritis%3A+a+preliminary+pilot+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Equine+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study.</a> J Equine Vet Sci. 27 (4), 167-170 (2007).</li>
<li>Dejnek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+of+blood+cell+components%2C+inflammatory+cytokines+and+growth+factors+in+autologous+platelet-rich+plasma+obtained+by+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Orthop%22%5BJournal%5D)">Content of blood cell components, inflammatory cytokines and growth factors in autologous platelet-rich plasma obtained by various methods.</a> World J Orthop. 13 (6), 587-602 (2022).</li>
<li>Giraldo, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+breed%2C+sex+and+age+on+cellular+content+and+growth+factor+release+from+equine+pure-platelet+rich+plasma+and+pure-platelet+rich+gel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of the breed, sex and age on cellular content and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel.</a> BMC Vet Res. 9, 29(2013).</li>
<li>Zimmermann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+technique+and+white+cell+content+influence+the+detectable+levels+of+growth+factors+in+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates.</a> Vox Sang. 85 (4), 283-289 (2003).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette per la raccolta del sangue venoso da 10 mL</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti</td><td>Riferimento 366430</td><td>Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare tubi di altre marche.</td></tr><tr><td>Provette da 4,5 mL di citrato di sodio (105 M/3,2%)&nbsp;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti</td><td>107451</td><td>Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare tubi di altre marche.</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Germania</td><td></td><td>Possono essere utilizzate altre centrifughe da banco.</td></tr><tr><td>Ago a farfalla (21 G & volte; 0,75 pollici) con 12 pollici. tubo e supporto prefissato&nbsp;</td><td>Set per la raccolta del sangue Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>Rif: 367296</td><td>Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare aghi a farfalla di altre marche.</td></tr><tr><td>Soluzione schiumogena di clorexidina al 2,3-4%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese.</td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare di classe II</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti</td><td></td><td>Possono essere utilizzate altre cappe a flusso laminare di classe II</td></tr><tr><td>Lettore ELISA</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcol etilico al 95%</td><td></td><td></td><td>Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese.</td></tr><tr><td>Umano PDGF-BB DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, Stati Uniti</td><td>DY220</td><td></td></tr><tr><td>Umano TGF-beta 1 DouSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, Stati Uniti</td><td>DY240</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di schiuma di iodio povidone al 4-10%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese.</td></tr><tr><td>Software SPSS 25.0</td><td>IBM Corp, SPSS, NY, STATI UNITI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe luer sterili di vari volumi&nbsp;</td><td>Siringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td>Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare siringhe di altre marche.</td></tr><tr><td>Ago spinale sterile (18 G & volte; 90 mm)&nbsp;</td><td>Ago di spinello BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti</td><td></td><td>Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare aghi spinali di altre marche.</td></tr></tbody></table>

un semplice metodo di doppia provetta per centrifugazione per ottenere plasma ricco di piastrine dal sangue equino

A Simple Double Centrifugation Tube Method to Obtain Platelet-rich Plasma from Equine Blood

La conta piastrinica media (piastrine × 103/μL) era significativamente più alta nel PRP rispetto al sangue intero (p &lt; 0,001). Al contrario, la concentrazione media di leucociti (leucociti × 103/μL) nel PRP era significativamente inferiore a quella nel sangue intero (p &lt; 0,001) (Tabella 1). In particolare, la conta piastrinica nel PRP era 2,41 volte superiore a quella del sangue intero, mentre la concentrazione di leucociti nel PRP era 0,44 volte inferiore. L'efficienza di rac...

Un semplice metodo di doppia provetta per centrifugazione per ottenere plasma ricco di piastrine dal sangue equino

Platelet-rich plasma (PRP) is widely utilized as a routine treatment for chronic musculoskeletal conditions in horses, such as osteoarthritis, ...

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Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.

Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane

Questo video mostra la preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP) di alta qualità mediante screening per la conta piastrinica, raccolta e centrifugazione del sangue e isolamento delle piastrine. Questo PRP è utilizzato in applicazioni terapeutiche per la rigenerazione e la guarigione dei tessuti.

Preparazione di plasma ricco di piastrine da sangue periferico umano

Delineiamo una metodologia per il trattamento del sangue intero per ottenere una varietà di componenti per ulteriori analisi. Abbiamo ottimizzato un protocollo semplificato che consente l'elaborazione simultanea rapida e ad alta produttività di campioni di sangue intero in un contesto non clinico.

Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità

'Leucociti-Piastrine Ricche di Fibrina (L-PRF) rappresenta una preparazione approvata dalla FDA di concentrati piastrinici autologhi che possiede un'architettura unica della fibrina, piastrine arricchite e abbondanti fattori di crescita. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di L-PRF alla poltrona e ne valutiamo le proprietà meccaniche, inclusi i test uniassiali e i test di forza di ritenzione della sutura.

Caratterizzazione di leucociti-piastrine Rich fibrina, un biomateriale Novel

Descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di piastrine lavate dal sangue umano seguita da agonista indotta misurazioni aggregazione piastrinica turbidimetria. A titolo di esempio applichiamo questo metodo per lo studio della risposta di aggregazione delle piastrine umane al collagene dopo un pre-incubazione con l'inibitore del canale Pannexin1 blu brillante FCF.

Turbidimetria su Human Lavato Piastrine: l&#39;effetto della Pannexin1-inibitore blu brillante FCF sul livello di aggregazione indotta dal collagene

In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare endoteliale von Willebrand fattore rilascio e la successiva della piastrina catturare sotto sollecitazione di taglio fluido in risposta a stimoli infiammatori, utilizzando un sistema di alloggiamento del flusso in vitro .

Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String

Qui, il sangue del topo è stato raccolto in presenza di un anti-coagulante. Le piastrine sono state purificate dal mezzo gradiente di Ioexolo usando la centrifugazione a bassa velocità. Le piastrine sono state attivate con trombina per indagare se fossero vitali. La qualità delle piastrine purificate è stata analizzata mediante citometria a flusso e microscopia.

Purificazione delle piastrine dal sangue del topo

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione clinicamente implementabile di pbmc di alta qualità e biocampioni al plasma nel sito di sperimentazione clinica che possono essere utilizzati per l'analisi del biomarcatore trascizionale.

Preparazione di pellet e plasma di cellule mononucleari periferici da un singolo estrapolazione di sangue presso siti di studio clinico per l'analisi dei biomarcatori

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Il metabolismo piastrinico è di interesse, in particolare per quanto riguarda il ruolo dell'iper- e dell'ipoattività piastrinica nel sanguinamento e nei disturbi trombotici. L'isolamento delle piastrine dal plasma è necessario per alcuni saggi metabolici; Qui viene presentato un metodo per isolare i metaboliti intracellulari dalle piastrine lavate.

Preparazione di piastrine umane lavate per studi quantitativi sul flusso metabolico

Scopri un metodo semplice ed economico per preparare plasma ricco di piastrine dal sangue equino. Questa tecnica di centrifugazione in doppia provetta garantisce concentrazione piastrinica elevata e riduzione dei leucociti per la medicina rigenerativa veterinaria.

Un semplice metodo di doppia provetta per centrifugazione per ottenere plasma ricco di piastrine dal sangue equino

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