Un protocollo di citometria per elettroporazione per microscopia a fluorescenza su cellule vive utilizzando la coltura cellulare U2 OS

Lo scopo di questa ricerca si concentra sull'effetto dei campi elettrici pulsati sul comportamento delle cellule, in particolare su come l'elettroporazione influisce sul ciclo cellulare.

Il vantaggio principale di questo protocollo è la capacità di eseguire esperimenti continui di elettroporazione su cellule vive utilizzando colture cellulari di mammifero per un massimo di 72 ore. Il nostro laboratorio si concentra sull'adattamento di queste tecniche per la microfluidica, che consentirà di ridurre le dimensioni dei campioni, ridurre i requisiti di reagenti e migliorare il controllo dei campioni per i protocolli futuri.

[Narratore] Per iniziare, coltivare le cellule U2OS FUCCI CA5 in una piastra di 10 centimetri con 10 millilitri di DMEM ad alto glucosio contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente con il 5% di anidride carbonica. Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, aspirare il terreno dalla piastra. Lavare le cellule con PBS, quindi aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,25% e incubare per 1,5 minuti per dissociare le cellule. Neutralizzare la tripsina risospendendo le cellule dissociate in cinque millilitri di DMEM ad alto glucosio. Prelevare un campione da 100 microlitri dalla coltura risospesa e posizionarlo sul vetrino di vetro inferiore all'interno della camera del sistema di citometria per elettroporazione. Assicurarsi che la camera sia confluente al 30% dopo l'introduzione del campione. Aggiungere lentamente quattro millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio all'estremità più lontana della camera, evitando che il liquido fuoriesca dal campione. Posizionare un vetrino da microscopio standard sulla camera e incubare la camera a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Accendere il microscopio a fluorescenza invertito con una camera di controllo ambientale per consentire al sistema di stabilizzarsi prima dell'elettroporazione. Mentre la camera climatica si sta stabilizzando, utilizzare cavi a coccodrillo per collegare un multimetro digitale al condensatore del generatore di impulsi e all'interruttore ad alta tensione per una rapida configurazione con la camera di elettroporazione. Ora, seleziona l'ingrandimento 20x sul microscopio. Nel software del microscopio, assicurarsi che i canali FITC/GFP e A594 Texas Red M Cherry siano selezionati corrispondenti alle due proteine fluorescenti nel sistema FUCCI CA5. Utilizzare impostazioni di esposizione bassa, in genere inferiori a 0,05 secondi, per evitare danni alla foto durante l'imaging a lungo termine. Scatta immagini di prova per ottimizzare la messa a fuoco e la qualità dell'immagine prima di avviare l'imaging time lapse. Programma il time lapse per acquisire immagini da tre a sei punti di vista diversi ogni 10 minuti per un periodo di 24 ore per ottenere un volume elevato di dati sul ciclo cellulare per time lapse, mitigando al contempo i danni fotografici. Assicurarsi che la messa a fuoco automatica sia abilitata per il canale A594 per ottimizzare il tracciamento della cultura durante il time lapse. Lasciare il software aperto fino al completamento dell'elettroporazione. Posizionare la camera di citometria per elettroporazione nel microscopio dotato di un'apposita camera ambientale. Prima dell'elettroporazione, tenere chiusa la camera e assicurarsi che il sistema ambientale rimanga in funzione per mantenere le condizioni corrette del ciclo cellulare. Aprire la camera ambientale e collegare un multimetro digitale al generatore di impulsi, quindi utilizzando i cavi a coccodrillo, collegare il generatore di impulsi agli elettrodi della camera. Caricare il condensatore del generatore di impulsi a 180 volt. Scaricare rapidamente l'impulso nella camera fino a quando il multimetro digitale non visualizza zero volt. Rimuovere tutti i collegamenti elettrici dalla camera e riposizionare prontamente il coperchio della camera per garantire condizioni di coltura ottimali. Attiva immediatamente l'imaging time lapse una volta che la camera climatica è saldamente in posizione. Al termine del time lapse, utilizzare il software del microscopio per salvare tutte le immagini acquisite come un unico video. Regola la qualità visiva per migliorare la chiarezza delle caratteristiche delle celle per la quantificazione manuale. Infine, osserva i cambiamenti nei segnali FITC e A594 nel tempo per tenere traccia delle fasi cellulari nel video time lapse. Utilizzando il sistema Fuji, i dati visivi sono stati raccolti monitorando i cambiamenti di colore legati all'espressione proteica e all'ubiquitinazione, consentendo una chiara distinzione delle fasi G1, S, G2, M. Ciò ha permesso l'osservazione diretta della progressione del ciclo cellulare in condizioni variabili. Questa figura fornisce un riepilogo dei dati chiave raccolti da due serie di esperimenti utilizzando colture cellulari non sincronizzate e sincronizzate in fase S. L'esposizione al campo elettrico pulsato in celle non sincronizzate ha aumentato significativamente la lunghezza media delle fasi G1, G2 e M, mentre la fase S è rimasta invariata. Nelle celle sincronizzate, l'esposizione al campo elettrico pulsato ha portato a una riduzione della durata delle fasi G1, S e G2, sebbene solo S e G2 fossero statisticamente significative, mentre la fase M rimaneva inalterata.