Name: Preparazione e mantenimento dellesperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Impara a trasferire microbiota fecale umano in topi privi di germi utilizzando gabbie isopositive per studiare il ruolo del microbioma nello sviluppo del cancro e nelle risposte terapeutiche.

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I topi privi di germi sono uno strumento essenziale nel repertorio dei ricercatori sul microbioma, che consente di analizzare il contributo del microbiota nella salute dell'ospite e negli stati di malattia. I topi privi di germi nascono completamente sterili e rimangono axenici per tutta la vita1. La colonizzazione di topi privi di germi con ceppi batterici specifici consente studi causali tra questi taxa e le funzioni metaboliche, immunitarie o altre funzioni dell'ospite 2,3,4,5. Particolarmente vantaggiosa è la capacità di "umanizzare" topi germ-free a livello del microbiota trapiantando feci ottenute da donatori umani e, se alloggiati in condizioni di barriera, prevenire la contaminazione da microrganismi di origine murina1. Questo approccio ha permesso molte importanti scoperte nel campo del microbioma, ad esempio l'effetto del microbioma intestinale umano sulla risposta all'immunoterapia del cancro 6,7,8.
Tuttavia, mentre i topi umanizzati privi di germi sono inestimabili per gli sforzi di ricerca nel campo del microbioma, ci sono molte limitazioni che hanno inibito il più ampio adattamento di questo approccio. I topi privi di germi vengono allevati e mantenuti in grandi isolatori semirigidi o a film flessibile, ma gli esperimenti funzionali richiedono l'installazione di mini-isolatori separati, con un mini-isolatore che ospita diverse gabbie ma solo in una condizione sperimentale. Questo approccio mini-isolatore aumenta l'ingombro e i costi, limitando al contempo il numero di condizioni sperimentali che possono essere studiate in un esperimento e il numero di esperimenti che possono essere eseguiti in parallelo. Una soluzione promettente consiste nell'utilizzo di un sistema di ingabbiamento modulare e individuale chiamato ISOcage P Bioexclusion System (qui denominato sistema isocage)9,10. Il sistema isocage consente la manipolazione sperimentale di topi privi di germi in gabbie isolatrici individuali, sigillate ermeticamente e a pressione positiva, consentendo condizioni sperimentali separate tra ciascuna gabbia piuttosto che tra ciascun mini-isolatore. Con la corretta tecnica asettica, gli animali possono essere alloggiati in isogabbie per un massimo di 12 settimane in condizioni prive di germi o umanizzati mediante trapianto fecale umano per l'uso in qualsiasi approccio sperimentale compatibile (cioè, possono essere eseguiti in condizioni asettiche). È possibile eseguire più esperimenti indipendenti in parallelo utilizzando il sistema isocage e l'ingombro e il costo sono notevolmente inferiori rispetto all'esecuzione di più esperimenti su mini-isolatori.
Lo scopo dell'allevamento di topi privi di germi in isolatori di riproduzione a film flessibile è quello di preservare attentamente lo stato axenico11. Le tecniche utilizzate per monitorare lo stato privo di germi includono tamponi di routine delle superfici corporee dei topi e delle cavità orali, nonché la raccolta asettica di campioni fecali, che vengono sia coltivati che testati mediante test commerciali basati su PCR. I test batterici, sierologici e fungini di questi campioni sono tutti necessari per determinare lo stato privo di germi11. Quando i topi privi di germi vengono trasferiti dagli isolatori di riproduzione alle isogabbie per l'uso sperimentale, i topi vengono sottoposti a tampone e testati per convalidare il loro stato privo di germi al momento del trasferimento. I controlli di sterilità Isocage vengono eseguiti attraverso la raccolta asettica di campioni fecali, che vengono poi coltivati per la rilevazione di contaminanti batterici, virali e fungini. Per convalidare lo stato di germ-free di questi topi è necessario raccogliere e registrare attentamente i risultati di questi controlli di sterilità dalla nascita alla fine di un protocollo sperimentale.
Il sistema di isocage è composto da gabbie individuali (Figura 1), dischi di trasferimento per il trasporto fuori dagli isolatori di allevamento (Figura 1) e la rastrelliera per isocage, che ospita le gabbie (Figura 2). Ogni isogabbia contiene un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) a livello di gabbia installato sulla presa d'aria di mandata e una guarnizione in silicone che crea una tenuta ermetica quando è chiusa, assicurando che nessun contaminante possa entrare nella gabbia attraverso l'aria (Figura 1A). Questo coperchio della gabbia può essere utilizzato come superficie di lavoro sterile se posizionato capovolto all'interno di una cabina di biosicurezza sterilizzata (Figura 1A). Una griglia all'interno della gabbia contiene il cibo e la bottiglia d'acqua (Figura 1B). Le pinze sterilizzate in autoclave all'interno della gabbia vengono utilizzate per tutte le manipolazioni che richiedono il contatto con le superfici interne della gabbia. La gabbia stessa è dotata di tacche per un supporto per schede di gabbia rimovibile per identificare gli animali all'esterno e di ugelli di aspirazione ed esportazione dell'aria che si agganciano al rack isocage (Figura 1C-E). I morsetti di chiusura sicuri e un blocco della linguetta sul coperchio sigillano la gabbia quando è pronta per essere riagganciata al sistema di scaffalature (Figura 1F). La lettiera suggerita è l'Alpha-dri e si raccomanda anche una capanna di arricchimento autoclavabile (Figura 1F). I dischi di trasferimento vengono utilizzati per spostare i topi privi di germi dagli isolatori di riproduzione alle isogabbie e contengono un coperchio a scomparti girevole con un'apertura triangolare per consentire la manipolazione degli animali (Figura 1G-H). I dischi sono disponibili nelle dimensioni piccola (21,6 cm di diametro) e grande (28 cm di diametro), entrambe con una capacità di otto topi. Il nastro autoclavato viene utilizzato per creare guarnizioni ermetiche sulla circonferenza e sui fori d'aria del disco, che viene eseguito prima dell'immersione con sterilizzante e del trasporto in una sacca imbevuta di sterilizzante (Figura 1I). Il sistema rack stesso dispone di uno schermo per monitorare i ventilatori d'aria, lo stato del filtro HEPA a livello di rack e l'alimentazione di emergenza della batteria per il rack, che sono tutte funzionalità incluse nel sistema (Figura 2A). Un manometro Magnehelic chiuso mostra la pressione positiva mantenuta dal sistema di gabbie e un indicatore visivo di attracco automatico mostra lo stato di attracco delle gabbie (la linguetta gialla indica che nessuna gabbia è agganciata o che il bacino non è riuscito a farlo) (Figura 2B-D). Per la manipolazione delle isogabbie è necessaria anche una cappa di biosicurezza certificata standard.
Il protocollo qui presentato descrive i metodi appropriati per il trasferimento di successo di topi privi di germi da isolatori di riproduzione in condizioni asettiche alle isogabbie mantenendo lo stato privo di germi, l'umanizzazione di topi privi di germi con liquame fecale di donatore umano e la raccolta di feci da topi ospitati nell'isogabbia per la conferma dello stato privo di germi o per la conservazione della vitalità per ulteriori studi funzionali. In questo esempio, i topi privi di germi sono umanizzati con campioni fecali aggregati da soggetti umani trattati con immunoterapia per il cancro del polmone e dicotomizzati come responder o non-responder alla terapia. In questo caso, il fenotipo di risposta alla risposta all'immunoterapia è stato trasferito dall'umanizzazione del microbiota intestinale ai topi riceventi, che hanno potuto essere ulteriormente inoculati con cellule tumorali e trattati con immunoterapia. Il protocollo del liquame fecale umano può essere facilmente adattato a qualsiasi fece di donatore umano o a qualsiasi modello preclinico di malattia che lo sperimentatore desidera. Utilizzando questo protocollo, è possibile trasferire qualsiasi microbiota fecale umano nel biopatico privo di germi, consentendo ulteriori indagini sul ruolo del microbiota nella salute e nella malattia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico dell'isogabbia e dei dischi di trasferimento. (A) Vista dall'alto verso il basso della parte inferiore del coperchio della gabbia, con etichette che indicano la posizione del filtro HEPA interno a livello della gabbia e della guarnizione in silicone. (B) Vista dall'alto verso il basso dell'interno della gabbia, con etichette che indicano il coperchio della barra metallica, la bottiglia d'acqua interna e il beccuccio e la posizione nella griglia per contenere il cibo autoclavabile. (C) Vista frontale della gabbia che mostra le tacche per il portacarte della gabbia. (D) Vista dall'alto verso il basso di una gabbia completa con il coperchio in alto, che mostra come il filtro HEPA è installato sull'ugello di aspirazione dell'aria. (E). Vista posteriore della gabbia che mostra gli ugelli di aspirazione e di esportazione dell'aria che si agganciano al sistema di scaffalature isocage. (F) Vista laterale di una gabbia completa con il coperchio in alto, con etichette che indicano i morsetti di chiusura sicuri in posizione aperta, con linguette bianche su ciascun morsetto che li bloccano in posizione. L'interno della gabbia mostra una lettiera Alpha-dri stratificata nella parte inferiore e una capanna di arricchimento suggerita collocata nella lettiera. (G) Vista dall'alto verso il basso dei dischi di trasferimento con coperchio in alto. (H) Vista dall'alto verso il basso dell'interno del disco di trasferimento, che mostra il coperchio del vano girevole con un'apertura triangolare per consentire la manipolazione degli animali. (I) Vista laterale del disco di trasferimento completamente assemblato che mostra il posizionamento del nastro autoclavato, che crea una chiusura ermetica durante il trasferimento dall'isolatore di riproduzione all'isogabbia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig02.jpg"> 
Figura 2: Diagramma schematico del sistema di rack isocage. (A) Rack isocage completo con gabbie agganciate e un'etichetta che indica la schermata di monitoraggio per lo stato del ventilatore d'aria, lo stato del filtro HEPA e la batteria di emergenza. Sul lato inferiore sinistro del rack si trova la fessura per il filtro HEPA a livello del rack. (B) Manometro Magnehelic allegato che mostra la pressione positiva mantenuta dalla cremagliera. (C) Un'isogabbia agganciata senza indicatore di attracco giallo visibile, che dimostri un collegamento riuscito tra il rack e gli ugelli dell'aria. (D) Una fessura vuota nel rack, con un indicatore visivo visivo visibile che indica che non è presente alcun rack in posizione e che non vi è alcun collegamento degli ugelli dell'aria con un'isogabbia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Siringa con punta a slittamento BD da 1 mL sterile, monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Tubo con tappo a vite da 2,0 mL, non zigrinato, con gonna, naturale, E-Beam Tubo sterile con tappo attaccato</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>36 x 32 x 48" 3 Mil Sacchetti di polietilene a soffietto</td><td>Uline</td><td>S-13455</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio da 5 galloni di attivatore sterilizzante di biossido di cloro Exspor</td><td>Ecolab</td><td>6301680</td><td></td></tr><tr><td>serbatoio da 5 galloni di base sterilizzante al biossido di cloro Exspor</td><td>Ecolab</td><td>6301194</td><td></td></tr><tr><td>Becher in polipropilene da 600 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S01914</td><td></td></tr><tr><td>Lettiera ALPHA-dri</td><td>Shepherd Specialty Papers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera anaerobica</td><td>Coy Lab Prodotti</td><td>Tipo B</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza classe 2</td><td>Certificato Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro HEPA autoclavabile IsoCage XT Extreme Temperature</td><td>Tecniplast</td><td>1245ISOFHXT</td><td></td></tr><tr><td>Lenti trasparenti LPX IQuity Occhiali di sicurezza&nbsp;</td><td>Fastenal</td><td>922205455</td><td></td></tr><tr><td>DuPont Tyvek&nbsp; Manicotto - 18"</td><td>Uline</td><td>S-13893E</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences DURAN 45 mm Tappo in gomma naturale a pressione</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-258-107</td><td>Tappo in gomma per flaconi autoclave da 1 L</td></tr><tr><td>Dynalon Quick Mist Flaconi spruzzatore in HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-438-12B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran Cilindri graduati in polipropilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-44</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&nbsp; Pinze da dissezione a punta smussata</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-887</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Buste per sterilizzazione a chiusura istantanea</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pinze per applicazioni generali a punta larga e forte diritte</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-107</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Nastro per autoclave senza piombo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-110</td><td></td></tr><tr><td>Ago per sampie, acciaio inossidabile riutilizzabile. Diritto. Ago calibro 22, diametro della punta 1,25 mm, lunghezza 38 mm o 1,5 pollici (doz)</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK 020</td><td></td></tr><tr><td>H-B Instrument Durac Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-202-015</td><td></td></tr><tr><td>Gabbie e rack isopositivi (cioè gabbie isopositive)</td><td>Tecniplast&nbsp; &nbsp;</td><td>ISO30P</td><td>30 gabbie (6 l x 5 h),</td></tr><tr><td>guanti resistenti agli agenti chimici in nitrile su un lato taglia S (7), M (8) o L (9) 18" di lunghezza, 22 mil, guanti da esame in nitrile Ansell</td><td>Grainger</td><td>4T426</td><td></td></tr><tr><td>, medi, non sterili, senza polvere</td><td>MedSupply Partner</td><td>KG-1101M</td><td></td></tr><tr><td>oliva / magenta baionetta gas e Cartucce di vapore / Filtro antiparticolato 2Ct&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051138541878</td><td></td></tr><tr><td>Policarbonato RadDisk Mini per Topi 8-75 x 4</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilene Bouffant Caps - 24", Blu</td><td>Uline</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>S, M e L Blu Silicone Dual-Mode Head Harness Semimaschera Respiratore&nbsp;</td><td>&nbsp; Guanti in lattice sterili senza polvere serie 3M/Fastenal</td><td>50051131370826</td><td></td></tr><tr><td>Sgpf, CT International, spessore = 6,5 mm, lunghezza = 30,5 cm (12), misura del guanto = 8,5, colore del guanto = bianco</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-102F</td><td></td></tr><tr><td>Copriscarpe antiscivolo</td><td>Uline</td><td>&nbsp; S-25639</td><td></td></tr><tr><td>Camice chirurgico, asciugamano, sterile, grande, 32/cs</td><td>Thomas Scientific</td><td>KIM 95111</td><td></td></tr><tr><td>Teklad Global 18% dieta per roditori estrusi con proteine al 18% (sterilizzabile)&nbsp;</td><td>Inotiv</td><td>2018SX</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Serbatoio rettangolare in LLDPE per impieghi gravosi con coperchio (volume 20 L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-831-330J</td><td></td></tr><tr><td>VERIFY Indicatori biologici autonomi a doppia specie</td><td>Steris Healthcare</td><td>S3061</td><td></td></tr><tr><td>WypAll L40 1&frasl; 4 Pieghe Tergicristalli</td><td>Uline</td><td>S-8490</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

I campioni fecali umani, raggruppati per fenotipo ICI responder e non-responder (precedentemente descritto nel protocollo), sono stati suddivisi in topi GF-WT di genere misto ospitati in 3 isogabbie per gruppo (n = 1-2 topi/gabbia, n = 6 per il responder e n = 5 per il non-responder). I topi sono stati lasciati acclimatare per 1 settimana dopo il trasferimento. Campioni fecali sono stati quindi raccolti da questi topi (condizioni prive di germi). I topi sono stati quindi sottoposti a sonda con 1 × 107 CFU di f...

Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra il metodo per generare un topo BLT (midollo, fegato e timo) osseo umanizzato doppio con un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale stabile simile a quello umano innestato.

Generazione di un modello murino BLT (midollo osseo, fegato, timo) doppiamente umanizzato

Questo video mostra una procedura di trapianto di microbiota fecale in un topo carente di interleuchina-10 con infiammazione del colon. I microbi fecali colonizzati nell'intestino rilasciano metaboliti secondari, provocando il rilascio di citochine antinfiammatorie e riducendo l'infiammazione del colon.

Valutazione degli effetti del trapianto di microbiota fecale in un topo carente di interleuchina-10

C'è un crescente interesse per la caratterizzazione quantitativa dei linfociti intestinali a causa del crescente riconoscimento che queste cellule svolgono un ruolo critico in una varietà di malattie intestinali e sistemiche. In questo protocollo, descriviamo come isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti dell'intestino tenue per la successiva caratterizzazione citofluorimetrica.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

Descriviamo un nuovo metodo per generare doppi topi BLT umani umani umani che presentano un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale innestato stabile. Questo protocollo può essere seguito senza la necessità di topi privi di germi o strutture gnotobiotiche.

Un modello di topi BLT a doppia umanizzata caratterizzato da un microbioma intestinale umano stabile e un sistema immunitario umano

L'interazione tra suscettibilità genetica, immunità mucosa e ambiente microecologico intestinale è coinvolta nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). In questo studio, abbiamo applicato il trapianto di microbiota fecale a topi carenti di IL-10 e abbiamo studiato il suo impatto sull'infiammazione del colon e sulla funzione cardiaca.

Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

L'obiettivo qui è quello di delineare un protocollo per studiare i meccanismi della disbiosi nelle malattie cardiovascolari. Questo documento discute come raccogliere e trapiantare asetticamente campioni fecali murini, isolare l'intestino e utilizzare il metodo "Swiss-roll", seguito da tecniche di immunocolorazione per interrogare i cambiamenti nel tratto gastrointestinale.

Isolamento fecale murino e trapianto di microbiota

Qui, descriviamo la struttura e le procedure operative, comprese le misure di contenimento microbico di una struttura per "topi selvatici" utilizzando come esempio il campionamento del sangue per l'immunofenotipizzazione.

Procedure operative e di biocontenimento di una struttura per topi da laboratorio con un microbioma naturale: procedura di immunofenotipizzazione

Questo protocollo descrive in dettaglio l'assemblaggio di array di mini-bioreattori da utilizzare per la coltura a flusso continuo di comunità fecali complesse in condizioni anaerobiche. Discutiamo anche i metodi per l'assemblaggio, l'inoculazione e il campionamento dei reattori per ulteriori analisi.

Assemblaggio di bioreattori per la coltura continua di comunità fecali complesse

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per la colonizzazione di topi con pks+ Escherichia coli in condizioni non infiammatorie, nonché metodi non invasivi per la validazione della colonizzazione e la valutazione dell'espansione di pks+ E. coli nelle feci.

Colonizzazione con Escherichia coli di Murine pks+ in condizioni non infiammatorie

Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Impara a trasferire microbiota fecale umano in topi privi di germi utilizzando gabbie isopositive per studiare il ruolo del microbioma nello sviluppo del cancro e nelle risposte terapeutiche.

Preparazione e mantenimento dellesperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi (Video) | JoVE Journal

Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

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