Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Abbiamo studiato l'interazione tra i batteri e l'ospite e il nostro fattore interno ed esterno ha modificato questa relazione per cambiare la salute. In particolare, siamo interessati a comprendere il ruolo dei batteri nello sviluppo, nella progressione e nelle terapie del cancro. Noi e altri laboratori di microbioma utilizziamo il sistema di gabbie ISO positive per trasferire la comunità fecale dal soggetto umano a un ospite murino ricevente per creare una comunità microbica stabile e a lungo termine.

Questa tecnologia ci ha permesso di generare una nuova scoperta sul ruolo di batteri clinici rilevanti nella salute e nella malattia. Molti studi clinici prospettici hanno trovato associazioni tra microbi specifici e sviluppo, progressione e risposta al trattamento del cancro, ma la correlazione non implica la causalità. L'umanizzazione di topi privi di germi con campioni fecali umani consente di convalidare la relazione causale in modelli tumorali pertinenti.

Utilizzando il sistema di gabbie ISO positive, abbiamo dimostrato che specifici ceppi di bacteroides provenienti da pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule che rispondono all'immunoterapia umana conferiscono una risposta ai topi portatori di tumori polmonari ortotopici. Per iniziare, metti 10 salviette nel serbatoio dell'immersione sterilizzante al biossido di cloro e assicurati che siano completamente insaponate. Quindi, utilizzando un cilindro graduato, riempire un grande sacchetto di plastica con almeno 100 millilitri di sterilizzante al biossido di cloro.

Agitare la borsa per assicurarsi che tutte le superfici interne siano bagnate e metterla da parte. Rimuovere una singola gabbia ISO dal rack e posizionarla nel serbatoio di immersione sterilizzante al biossido di cloro, garantendo il pieno contatto con il liquido. Usa salviette imbevute per strofinare tutte le superfici della gabbia.

Dopo aver immerso la gabbia, chiedi a un assistente di aprire il sacchetto di plastica inzuppato. Posizionare la gabbia all'interno e chiudere immediatamente l'apertura. Utilizzando un flacone spray, spruzzare l'apertura del sacchetto con uno sterilizzante al biossido di cloro.

Una volta che tutte le gabbie e le forniture sono state imbustate, immergere i guanti resistenti agli agenti chimici in uno sterilizzante al biossido di cloro. Nel frattempo, sposta le salviette imbevute nella cabina di biosicurezza e immergi tutte le superfici. Per le superfici non protette, spremere le salviette su di esse senza toccarle.

Dopo 20 minuti, utilizzando guanti sterilizzati resistenti agli agenti chimici, spostare ogni gabbia e bottiglia nell'armadio di biosicurezza sterilizzato. Per aprire la gabbia ISO ermeticamente sigillata, sollevare le linguette bianche sui due morsetti ai lati del coperchio ed estrarre ciascun morsetto lateralmente per sbloccare il coperchio. Usando la pinza sterile all'interno della gabbia sopra la griglia, rimuovi la bottiglia d'acqua vuota e posizionala all'interno del coperchio.

Rimuovere la guarnizione in gomma e versare l'acqua nella bottiglia per riempirla. Usando una pinza sterile, posiziona l'ugello sulla bottiglia d'acqua e premi con decisione per sigillare. Quindi, con una pinza sterile, sollevare la griglia e farla scorrere indietro di diversi centimetri per creare un'apertura sul fondo della gabbia.

Appoggiare le pinze sterili sulla griglia, assicurandosi che le maniglie non entrino in contatto con le superfici della gabbia. Dopo aver ricevuto il disco di trasferimento, chiedere all'assistente di tenere e srotolare parzialmente il coperchio di plastica in modo che la superficie imbevuta sia esposta ma non toccata. Indossando guanti resistenti agli agenti chimici imbevuti di sterilizzante al biossido di cloro, rimuovere il disco di trasferimento dall'involucro di plastica e posizionarlo su una superficie piana all'interno della cabina di biosicurezza sterilizzata.

Per aprire il disco di trasferimento, staccare il nastro che sigilla la circonferenza del disco e quindi rimuovere il coperchio. Successivamente, utilizzando la pinza sterile precedentemente appoggiata sulla griglia, manipolare il coperchio dello scomparto per allineare l'apertura con il mouse da trasferire. Utilizzando una pinza sterile, afferrare la base della coda del topo attraverso l'apertura nel coperchio del disco di trasferimento, sollevare e trasferire il mouse nella gabbia ISO attraverso l'apertura tra la griglia e la gabbia.

Una volta che tutti i topi sono stati trasferiti, sostituire la griglia con la pinza sterile. Sollevare il coperchio della gabbia e riposizionarlo sopra la gabbia. Sollevare ogni morsetto del coperchio della gabbia verso l'alto e abbassarlo con cautela sui lati della gabbia.

Spingere verso il basso le linguette bianche per sigillare saldamente il coperchio della gabbia. A questo punto, chiedere all'assistente di spruzzare ogni ugello del sito di attracco sul rack della gabbia con uno sterilizzante al biossido di cloro. Rimuovere la gabbia dalla cabina di biosicurezza e agganciarla al rack della gabbia.

Dawn un nuovo camice chirurgico sterile e guanti chirurgici sterili al posto dei guanti resistenti agli agenti chimici. Per preparare gli aghi per la sacca, scartare ogni sacca di sterilizzazione e utilizzare l'interno della sacca come superficie di riposo sterile e asciutta. Collegare l'ago della sonda gastrica alla siringa.

Aprire il tubo del liquame fecale e aspirare 200 microlitri di liquame in ogni siringa. Usando una pinza, afferrare la base della coda del topo e posizionarla sulla griglia. Trattieni delicatamente il mouse strofinando la pelle flaccida dietro il collo.

Tenendo il mouse in posizione verticale verticale, inserire l'ago della sonda e iniettare delicatamente il liquame fecale. Rimuovere immediatamente l'ago dopo l'iniezione. Posizionare il mouse direttamente in una delle tazze sterilizzate per l'osservazione.

Dopo che tutti i topi hanno ricevuto il gavagage, usa una pinza per riportare ogni topo nel letto della gabbia. La struttura umanizzata della comunità fecale di topo era significativamente diversa tra i fenotipi di risposta in tutti e tre i punti temporali. I topi colonizzati con feci responder non hanno mostrato differenze nella struttura della comunità microbica tra la prima e la seconda e la quarta settimana.

Mentre le feci non responder, i topi colonizzati hanno mostrato una struttura della comunità microbica diversa tra la prima e la seconda settimana, ma una struttura simile tra la seconda e la quarta settimana. Gli inoculi dei donatori umani hanno mostrato una maggiore rappresentazione di Blautia, Eubacterium, ruminococco e streptococco, mentre i topi riceventi avevano una maggiore abbondanza relativa di bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia e Parabecteroides.